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(無題) 削除/引用 No.1325-3 - 2009/10/10 (土) 14:10:23 - ~ �@whiteコロニーをpickしても外れてしまうなぞについて トランスポジションでおかしな状態になっていて、LacZが発現していないのかもしれません。 ついでにPCRでインサートが入っていないと判断したサンプルも読んでみれば、どうなっているのかは分かるでしょう。 �Aそもそもコロニーの出現率が極めて低いと言うこと。 500個コロニーが出る条件の1/9倍量を撒いたときに、コロニーの出現率が1/9よりもかなり低いということですよね。 大腸菌を焼き殺していたりしませんか？ 量が多いとコーンラージ棒が冷えるまで生き残れる菌がいるので、コロニーが出るようになります。

(無題) 削除/引用 No.1325-2 - 2009/10/10 (土) 11:59:58 - yama >transformして４時間震盪培養後、plateにまくのですが、その原液100 ulをまいても１つのコロニーしか出てきません。 >ところが不思議なことに原液の残り900 ulをまくと500個くらいのコロニーが出ます。 ここの意味がわからないのですが、プロトコルを見たところ100ulのコンピに900ulのSOCを入れて回復培養した後 プロトコルでは10倍ずつ希釈した(1/10 1/100 1/1000)ものを100ulプレートにまくように書いてありますが ここで原液を100ulまいているということでしょうか？ 残りの900ulはこのときに同時にまいているのでしょうか？ つまり、単純にまく量を9倍にすればコロニーが出るけどはずれが多いという ことでしょうか？ 青白選択はここでもかなり意見が出てたと思いますが当たりが青コロニーということは良くある事です。今回やられてる実験中でも白コロニーの中に当たりとはずれが混在しているようですし、あまり信じない方が良いのではないかと思います。 ピックするときに青コロニーも一緒にやってみてはいかがでしょうか？ また、一番重要なのは白コロニー中の当たりが発現しない方だと思うのですが、そっちは良いのでしょうか？ シークエンスで読んでいる部分以外にmutationがあるとか そのタンパクがtoxicで発現しづらいとかそういう事はありませんか？

DH10Bacに形質転換後の白コロニーが駄目な訳 削除/引用 No.1325-1 - 2009/10/09 (金) 20:54:24 - bacuro いつもbio technical forumで勉強させていただいていますD2のbacuroと申します。 よろしくお願いします。 Bac-to-Bacのシステムを利用して目的遺伝子を組み込んだpFASTbac1をDH10Bacにtransformしました。 しかし、Bac-to-Bacの手順書にあるようにプレートにまいてもコロニーの出現率が非常に悪いです。 transformして４時間震盪培養後、plateにまくのですが、その原液100 ulをまいても１つのコロニーしか出てきません。 ところが不思議なことに原液の残り900 ulをまくと500個くらいのコロニーが出ます。 青白選択が出来、whiteコロニーを15個ほどpickするのですがなかなか当たりません。 ここからバクミドを回収してPCRにてinsertの確認は出来ているのですが、Sf21で発現が見られません。ちなみにsequenceは合ってますし、フレームシフトなども起きてはいません。 かつて、作成したバクミド（ポジコンとして使用可能）はちゃんとSf21で発現してくれました。 質問から大きく反れてしまいました。すみません。 私の質問というのは、 �@whiteコロニーをpickしても外れてしまうなぞについて �Aそもそもコロニーの出現率が極めて低いと言うこと。 です。 ちなみにDH10Bacは最近購入したばかりのものです。

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