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(無題) 削除/引用 No.1320-22 - 2009/10/12 (月) 08:22:32 - おお >[Re:5] APさんは書きました : > ３ロットのうち2ロットはシングルバンド、1ロットは二本のバンドが検出されたことがあります。二本目のバンドは全く別のタンパク質に交差したというわけではなさそうで、このロットのみ、別ロットでは反応しない、アイソフォーム共通のエピトープに反応する抗体が出来ていたとようです。 本題にもどりますね。 書き込みですこし気になったことがあります。 2本バンドがでるロットがあったということですが、 2本のバンドの濃さとか、共通したバンドと 同じくらいの強度が得られたりしたわけでしょうか、 それともマイナーバンドのように見えたのでしょうか。 2本見えたバンドについて、何か感触はありますか? 燐酸かのような修飾、スプライシングアイソフォーム とか、、、、 あと話がそれたので前の発言をサイド以下にアップしておきます。 >[Re:16] おおさんは書きました : > チョット視点をかえた質問を加えたいと思います > (本質的に同じとはおもいますが)。 > > 例えばカスペースの全長から作った抗体。 > カスペースはプロセッシングでその複数のフラグメント > からなるアクティブなコンプレックスをつくります > (たしか30kDaくらいと10kDa強だったと、、)。 > > 同じサンプルをつかって、違うロットでこの2つの > サブユニットのシグナル強度の比がかわったとか > そういう経験、感触があるかたはいないかなぁと、、、 >

(無題) 削除/引用 No.1320-21 - 2009/10/11 (日) 13:33:30 - おお >[Re:19] 本気さんは書きました : > 言いたいことは、 > > では、自分で抗体を作って目的のタンパク質が５０ｋDaのタンパク質だったとします。 > > その抗体でウエスタンをしたら５０ｋDaのタンパク質を認識した。 > →よし、目的の抗体ができた。 > > これだけで、そう判断しますか？ しません。そんなことは分かっていますので、 このとぴで、論じていただく必要はありません。 わたしは、経験的でもなんでも良いので、いろいろな 可能せいが探れるものが欲しいだけです。 ですから、個々のサジェスチョンの正確性については とぴ主の私がが不思議に思ったら質問させていただきますので、 これ以上の追及はここでは結構です。 もし、そのバンドについてお互い研究していて、論文を 書いたりする時はご指摘の議論が必要ということは 重重承知しておりますのでご安心ください。 > > だから、大腸菌由来のタンパク質に対する抗体はないと決めてかかるのはダメでしょうとか言っているだけです。 大腸菌のタンパクに対する抗体はできてると思います。 結構大腸菌のトータルのタンパクでウエスタンすると いろんなバンドが出る抗体はあります。 それでもヒトで十分精製せずにつかえる抗体があります。 この辺ですれ違っているだけのようなきがしますが。。。 > > ＞経験上あるいは > 一般的な話として、そういうのがないと仰っていると思うのですが、、 > > 簡単にわからない話でしょ。 > 一般的って、そんな話になりますか？ なり得るとおもいます。大腸菌からのリコンビナントの純度を かんがえて、大腸菌由来のものからの抗体ができ、ノンスペがでるとするなら、人のある特定のタンパクが染まりやすいとか傾向があるかもしれない のに、それが知る限りに置いてないなぁ、、、というはなしだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1320-20 - 2009/10/11 (日) 13:31:22 - AP >言いたいことは、 おっしゃっていることは、ほとんどの人には釈迦に説法、みんなそれくらいのことは十分熟知しているし、苦労しているところだとでしょう。 出来た抗体が、本物を認識しているか、交差反応なのかとの判定に慎重であるべきだなんて、あらためて説教するほどのことでもないでしょう。 これもあるかもしれない、あれもあるかもしれないというだけなら、いくらだって言えますし、可能性がまったくないなんて誰も言えないのはあたりまえ（悪魔の証明）です。でも、それだけなら机上の空論で論議が成り立ちません。私たちが知りたいのは、どういう事例でどういうことが起こったか、どういうときにどんな問題を生じたかと、どういう対処法があり何がうまくいったかいうプラクティカルな知見です。 どうせ書き込みの労をはらうなら、ほかの書き込みにケチをつけるためだけのコメントはやめて、もっと建設的にいきましょうよ。

(無題) 削除/引用 No.1320-19 - 2009/10/11 (日) 13:09:32 - 本気 言いたいことは、 経験があるからどうのこうの、こう予想されるからどうのこうの、 言えるのは限度があるということです。 ２つの抗体があって、 １つは１本のバンド １つは２つのバンド このどっちが本当の目的タンパク質を認識しているのか？ 予想を論じ合っても結局可能性の域を出ないということです。 どの可能性に偏ることなく、考えるべきだということです。 では、自分で抗体を作って目的のタンパク質が５０ｋDaのタンパク質だったとします。 その抗体でウエスタンをしたら５０ｋDaのタンパク質を認識した。 →よし、目的の抗体ができた。 これだけで、そう判断しますか？ 私だったら、免疫染色で発現場所がどうかとか、 RNAiしたらバンドが消えるとか、 in vitroで目的遺伝子のmRNAだけを翻訳させたものでも認識するとか、 最強は免沈した産物のアミノ酸配列をみることでしょうけど、 そこまではしないけど、どれかはするでしょう？ だから、大腸菌由来のタンパク質に対する抗体はないと決めてかかるのはダメでしょうとか言っているだけです。 ＞経験上あるいは 一般的な話として、そういうのがないと仰っていると思うのですが、、 簡単にわからない話でしょ。 免疫染色で発現場所がどうかとか、 RNAiしたらバンドが消えるとか、 in vitroで目的遺伝子のmRNAだけを翻訳させたものでも認識するとか このようなことした後で、一般的にいうことではなく、 個別の抗原、個別の環境、個別の方法、個別の研究室による話ではないでしょうか？ 全く同じ条件なんて、ほかの実験と違ってあり得ないですし。 しかも、動物の中でどのように抗原として認識されているのか、 どのような種類の抗体が作られているのかわからないのですから。 一般的って、そんな話になりますか？

(無題) 削除/引用 No.1320-18 - 2009/10/11 (日) 09:52:43 - おお よこですが、 >[Re:17] 本気さんは書きました : > ＞逆に問いたいのですが、たとえば大腸菌で融合タンパク質発現させて免疫したときに、不純物が抗原となったために由来生物中の別のタンパク質と反応する抗体が出来たと、言い切れるような例はありますか。 > > 何においても、言い切れることはない、と私は思います。 > 単純にいろいろな可能性があるから、それを頭に入れて APさんはきっとこの辺のことに興味があったので例を聞きたかった のだと思いますが、、、、なぜなら、ヒトのタンパクで大腸菌からの 抗原の純度が特異性に影響するならプライマリーには大腸菌のタンパク 由来の可能性が高いだろうと思えるから。 で大腸菌由来のものでないとしたら、抗原の純度って何を意味している んだろうか、っていうことですよね。ケラチンはよく聞きますけどね。 ま、抗原はいつも大腸菌から作るわけではないので、そういう意味で 純度というのは分からなくもないです。抗体の出来はたしかに抗原の ロットの影響があるかもしれませんね。 > > ＞由来生物で遺伝子を壊すとどちらのバンドも消えますし、転写調節の突然変異体で発現量が上昇したものではどちらの強度も高くなるので、少なくとも同じ遺伝子からの産物のフォームの違いであったと考えています。 > > 抗体で認識されるから、という結果だけでなく上記のような結果も加えられて、よりアイソフォームであるという可能性が高まったということではないですか？ APさんはアイソフォームに関してその根拠を 書かなかっただけで、おそらくそういうサポーティブな データーをもっているだろうなと察していましたが、、、 こういう場なので、すべてに置いて根拠を示していくに 至らない書き込みもあっていいかと思うのですが、、、 で、まだタンパクの配列を見ないとダメということですか? > > ＞逆に問いたいのですが（省略）そんなことはないです。 > > 「ない」と思い込むのはどうかとと思います。最初にも言いましたが > 何においても、言い切れることはない、と私は思います。 あのぉ、、ないとおっしゃっているのは、経験上あるいは 一般的な話として、そういうのがないと仰っていると思うのですが、、

(無題) 削除/引用 No.1320-17 - 2009/10/11 (日) 09:04:10 - 本気 ＞逆に問いたいのですが、たとえば大腸菌で融合タンパク質発現させて免疫したときに、不純物が抗原となったために由来生物中の別のタンパク質と反応する抗体が出来たと、言い切れるような例はありますか。 何においても、言い切れることはない、と私は思います。 単純にいろいろな可能性があるから、それを頭に入れて 鵜呑みにすることはダメだと言っているのです。 ＞由来生物で遺伝子を壊すとどちらのバンドも消えますし、転写調節の突然変異体で発現量が上昇したものではどちらの強度も高くなるので、少なくとも同じ遺伝子からの産物のフォームの違いであったと考えています。 抗体で認識されるから、という結果だけでなく上記のような結果も加えられて、よりアイソフォームであるという可能性が高まったということではないですか？ ＞逆に問いたいのですが（省略）そんなことはないです。 「ない」と思い込むのはどうかとと思います。最初にも言いましたが 何においても、言い切れることはない、と私は思います。 単純にいろいろな可能性があるから、それを頭に入れて鵜呑みにすることは研究者としてあるまじきだと思います。 私としては、抗体のロットで認識されるされないとか、 自分が思った結果は、ほかの実験でサポートすることや、 実際のバンドのタンパク質の配列を決定するとかで 複数の結果で証明することのほうが、建設的だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1320-16 - 2009/10/11 (日) 01:57:34 - おお チョット視点をかえた質問を加えたいと思います (本質的に同じとはおもいますが)。 例えばカスペースの全長から作った抗体。 カスペースはプロセッシングでその複数のフラグメント からなるアクティブなコンプレックスをつくります (たしか30kDaくらいと10kDa強だったと、、)。 同じサンプルをつかって、違うロットでこの2つの サブユニットのシグナル強度の比がかわったとか そういう経験、感触があるかたはいないかなぁと、、、

(無題) 削除/引用 No.1320-15 - 2009/10/11 (日) 01:49:25 - おお >[Re:11] あいうさんは書きました : > ロットが違っても同じようにいきそうな気がしますが、 > 自分がレビュワーだったら、ロット間の反応性の差について > 指摘しますね。 やはり私がうすうすでも感じているようなところは、 指摘があるかもしれないっていうことですね。 なかなかごまかせませんね(いかさまデーターを 出そうということではありませんが)。

(無題) 削除/引用 No.1320-14 - 2009/10/10 (土) 18:26:08 - 質問 クローンの数ですが蛋白質が大きいほどいっぱい出来そうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.1320-13 - 2009/10/10 (土) 15:49:48 - 中年 横気味ですが関連している問題について、免疫に詳しい方、教えてください。 ここで話題になっているような、精製したタンパク質でウサギを免疫した場合に出来る抗体って、ポリクローナルと言ってもどの位のクローン数なんでしょうか。数クローン？数十クローン？もちろん抗原によって違うものなんでしょうけれど、典型的にはどの位ということが分かっていたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1320-12 - 2009/10/10 (土) 14:57:57 - AP >あるロットだけ、２本のバンドがでる、その２本目のバンドはアイソフォーム？？ >こう考える根拠はそのバンドのタンパク質の配列を見てみる以外言えないでしょう。 由来生物で遺伝子を壊すとどちらのバンドも消えますし、転写調節の突然変異体で発現量が上昇したものではどちらの強度も高くなるので、少なくとも同じ遺伝子からの産物のフォームの違いであったと考えています。確かに本当にアイソフォームかどうかというのは確かめていないので、修飾やプロセッシングあるいは分解の結果じゃないかとか、いくらでも可能性はあがられるでしょうけれど、とにかく異なるフォームが存在していたことと、ロットによってどれが検出されるかという違いがあったことは間違いないです。 >抗原の純度の問題 >これをどうして無視するのでしょうか。 逆に問いたいのですが、たとえば大腸菌で融合タンパク質発現させて免疫したときに、不純物が抗原となったために由来生物中の別のタンパク質と反応する抗体が出来たと、言い切れるような例はありますか。対象としている生物種によって事情がことなることはあるでしょうが、基本的には融合タンパク質は材料生物由来、不純物は大腸菌由来です。残存する大腸菌由来の抗原に対する抗体ができたとして、それが別の生物のタンパク質と交差して問題になるというようなことはそうそう起こらないのではないでしょうか。もし、そういうことがあるなら、大腸菌で発現させたタンパク質で免疫するといつでも、あるいはしばしば、同じ由来生物に対して再現性よく反応する抗体というものが存在しそうですが、そんなことはないです。 むしろ、ウエスタンでエキストラバンドがでるとか、交差反応がでるとかいうのは抗原として注射したものが原因ではなく、免疫生物がもともと持っている抗体のせいという場合のほうがはるかに多ようです。余計なバンドというのはpreimmuneの血清でも検出されていたもので、免疫後にそれが濃くなっただけということが多いです。抗原を注射すると（とくに完全アジュバント化していたりすると）、抗原に対する抗体産生が誘発されるだけでなく、免疫系全体を刺激して全免疫グロブリンレベルも上昇しますので。

(無題) 削除/引用 No.1320-11 - 2009/10/10 (土) 13:00:23 - あいう ロットが違っても同じようにいきそうな気がしますが、 自分がレビュワーだったら、ロット間の反応性の差について 指摘しますね。

(無題) 削除/引用 No.1320-10 - 2009/10/10 (土) 03:31:56 - おお 理解を頂くためにもう少し情報を追加しておきます。 ちょっと実験に関して公開するのはためらっていたのですが、、、 今考えているタンパクはある実験条件で色々な断片がみられます。 その断片をキャラクタライズするのに、必要な領域をカバーした ポリクロを現在使わざるおえません。その断片自身まだ十分どこから どこまでと特定できてないですし、色々な断片の混合物の可能性が ありますから。 でたしかに抗原せいのない部分は拾えない可能性があるのですが、 それはこの系を使う限り仕方がないとして、購入している抗体 のロットや同じ会社でも違う研究グループでやっているデーター をどのように考慮して、実験するのがいいかと思っているわけです。

(無題) 削除/引用 No.1320-9 - 2009/10/10 (土) 00:31:58 - おお >[Re:4] ：さんは書きました : > 実際に、 > > そんなことに対して、何が聞きたいのですか？？ 他のグループが、260アミノ酸で免疫した売っている抗体 を使って、ここの部分は反応しなかったということを ある論文で出しています。 同社の違うロットの抗体で、そのデーターがどこまで再現 があるかと言う事が気になっているわけです。

(無題) 削除/引用 No.1320-8 - 2009/10/10 (土) 00:26:58 - おお >[Re:2] みさんは書きました : > ロットって精製のロットですか？ 精製のロットではなく、むしろ個体間とかですね。 また、同じ方法で作っている違う会社の抗体はとか、、、

(無題) 削除/引用 No.1320-7 - 2009/10/09 (金) 23:43:30 - c 同じ抗原を注射しても免疫動物の個体間で抗体の出来やすさとか質はかなり違いがあることはしばしばあります。なので通常はそれを見込んで２〜３匹使います。同じ個体でも抗体価が上がりだした比較的初期のころ得た抗血清とその後何回か注射を繰り返した後期の抗血清ではけっこう違ってきます。特異性の点では早い時期に得た抗血清の方が優れている場合が多いです。さらに免疫を続けた後の方だと何か変なエキストラバンドが出たりすることがあります。たぶん抗原調製や注射の際に混じったケラチンとかの微量のコンタミに対する抗体ができたりするのかもしれません。ロットをどのように定義するかにより話が違ってきますが、仮に同じ動物個体から同じ時に得た抗体をもって同一ロットというならば、上記のような理由で、ロットが異なれば反応性や特異性などの点でけっこう違いが出ることは十分あり得るとおもいます。 いい感じの抗体が出来たとわかった時点で全採血とかすれば良いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1320-6 - 2009/10/09 (金) 19:45:42 - 本気 あるロットだけ、２本のバンドがでる、その２本目のバンドはアイソフォーム？？ こう考える根拠はそのバンドのタンパク質の配列を見てみる以外言えないでしょう。 抗原の純度の問題 これをどうして無視するのでしょうか。 ポリクロとは、抗原溶液の中の不純物（たとえ少量でも）に対する抗体もポリクロで含まれるのでは？ ロットの違い云々を言及する前に、抗体が本当に目的のタンパク質を認識しているのか？ 常に注意を払うことを、慣れによって忘れたらだめでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1320-5 - 2009/10/09 (金) 12:37:18 - AP >ロットって精製のロットですか？ "lot"は、抗体作成の場面では免疫個体の区別を指します。同じ抗原を複数の個体に分けて免疫しても、それぞれから取得した血清や抗体は別ロットです。なぜこういう区別をするかというと、生き物相手ですから、遺伝的・環境的に個体差があるので、出来るものも性質が違ってくるからです。それでも、かなりアイソジェニック化されているマウス等ならロット差はそれほどでもないことがありますが、そうでないウサギや家畜だとてきめんです。 モノクロの場合は同じ細胞株から取ってくればそう言うことはないはずですが、サブクローンをよそから分けてもらったとか、凍結保存したのを起こし直してみたとかしたときに、オリジナルとちょっと抗体の性質が違うようだ、ということはしばしば見聞きします（トピの主旨とはすれますが）。 おおさんの質問ですが、おっしゃるようなことは免疫系の理屈から考えても、抗体作成について論じた数々の成書のいうところからもあると思います。私の経験では、融合タンパク質でマウスを免疫した抗体で、由来生物から抽出した全タンパク質をウェスタンブロットしたら、３ロットのうち2ロットはシングルバンド、1ロットは二本のバンドが検出されたことがあります。二本目のバンドは全く別のタンパク質に交差したというわけではなさそうで、このロットのみ、別ロットでは反応しない、アイソフォーム共通のエピトープに反応する抗体が出来ていたとようです。

(無題) 削除/引用 No.1320-4 - 2009/10/09 (金) 12:25:20 - ： 実際に、 ポリクロとは何種類の抗体からなっているのか？ 抗原になりやすさ、なりにくさを決定する機構はわからない（結果として抗原となりやすいとかはあるが） 抗原を細かく削って、各ロット間で認識の違いがあるのかを延々とやらないとわかりゃしない （しかも。その抗原の細分化の仕方もかなり煩雑、ちょうど切ったところをまたがって認識するかもとかあるから。） そんなことに対して、何が聞きたいのですか？？

(無題) 削除/引用 No.1320-3 - 2009/10/09 (金) 12:18:45 - は？ あるかもしれないし、ないかもしれない。

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