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(無題) 削除/引用 No.1320-44 - 2009/10/15 (木) 10:42:58 - 中年 Tbさま、うさま、PDIさま、 ポリクロに含まれるクローン数についての貴重な情報をありがとうございました。少なくともマウスでは、ポリクローナルというよりオリゴクローナル？勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.1320-42 - 2009/10/15 (木) 10:39:09 - PDI 一般的に動物種が大きいほど総リンパ数も多く、Ｂ細胞のバリエーションも増えると言われています。 従って、同一抗原に対しマウスに比べてウサギの方がよりポリクローナルな抗体になる可能性があるかと思います。 また、ウサギのブリードは数コロニーをローテーションしていると聞きました。ウサギポリクロ性能のlot間差の一因かと考えてます。

(無題) 削除/引用 No.1320-41 - 2009/10/15 (木) 01:31:04 - おお >[Re:38] うさんは書きました : > その教授は、いろんな抗原についてモノクロを作ったけど、 > 取れてくるクローンはいつも数種類のクローン、ってことは > ポリクロって言っても数クローンで成り立っているんじゃないか。 > > っておっしゃっていた。 > > あくまでお話だが。 あ、これ参考になります。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1320-40 - 2009/10/15 (木) 01:27:22 - おお >[Re:37] Tbさんは書きました : > >[Re:13] 中年さんは書きました : > > 一個体あたり３−５ヶ所のdominant epitopeが出るようです。タンパクが大きくなってもdominant epitopeの数は個体あたり上限があるのか、タンパクの大きさに比例していくらでもたくさん出でこられるのか、よくわかりませんが・・・。 20kDaで3-5かしょですか、、、考えようによっては 少ないかなあって、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1320-39 - 2009/10/15 (木) 01:24:40 - おお >[Re:36] Tbさんは書きました : > "lot"についてですが、少なくともR&D Systems Inc.では、 メーカーのロット管理の仕方なんかも把握できれば確かに 有意義ですね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1320-38 - 2009/10/14 (水) 13:22:12 - う 横レスですが、ポリクロはどのくらいのクローンからなっているのかについて。 私の知り合い教授で、ある生物のある部分にある、いろいろなタンパク質を電顕で染めるために モノクロを作り続けて20年近くという方がいらっしゃいまして、 雑談で同じことを話したことがあります。 その教授は、いろんな抗原についてモノクロを作ったけど、 取れてくるクローンはいつも数種類のクローン、ってことは ポリクロって言っても数クローンで成り立っているんじゃないか。 っておっしゃっていた。 あくまでお話だが。

(無題) 削除/引用 No.1320-37 - 2009/10/14 (水) 05:59:48 - Tb >[Re:13] 中年さんは書きました : > ここで話題になっているような、精製したタンパク質でウサギを免疫した場合に出来る抗体って、ポリクローナルと言ってもどの位のクローン数なんでしょうか。数クローン？数十クローン？も 一例として、マウスでドミナントエピトープがいくつくらい出てくるのか調べた論文があります。Mol Immunol. 1990 Jun;27(6):581-6.（似たような報告はたくさんもあるのでしょうが･･･）CH3マウスにウシα1-casein (23 kDa)を免疫したとき、血清の反応性をオーバーラッピングペプチドで調べると、一個体あたり３−５ヶ所のdominant epitopeが出るようです。タンパクが大きくなってもdominant epitopeの数は個体あたり上限があるのか、タンパクの大きさに比例していくらでもたくさん出でこられるのか、よくわかりませんが・・・。 遺伝的背景がそろっている純系マウスでも認識部位の個体間差が一部みられるのもおもしろいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1320-36 - 2009/10/14 (水) 05:15:38 - Tb "lot"についてですが、少なくともR&D Systems Inc.では、lotは精製ロットのようです。だいぶ昔の話ですが、ゴートとチキンのポリクロについてロット間、製品間（ノンラベル抗体とビオチン化抗体）の免疫ホストはどうなっているのか聞いたたことがあります。商品によって１匹のゴートであったり、複数個体の血清・鶏卵のプールだったりしますが、ロットとは精製ロットであり、元の血清・卵は同じ商品では同一だといっておりました。（ちなみに、ノンラベル抗体とビオチンか抗体はそれぞれ別個体からのものでした。） また、Jackson Immunoresearchでは、例えばanti-mouse IgG-HRPというものを同じカタログ番号で複数ロットを出しているのに、あるときカタログ番号が変わるということがあります。全くの推測ですが、これは免疫ホストの個体が変わったときにカタログ番号も変わるのではないかと思っています。 余談ながら、昔のR&D Systemsはテクニカルな質問すると実際に抗体作っている人にまで質問がいっている、あるはその人が直接答えているのではないかと思うくらい調べてくれましたが、今はパソコンカスタマーサポートみたいな形式的な答えしかくれませんね。ロット間の差は私も抱えている問題で、ホントは個体変えていない？、精製方法変えた？と最近も聞いたのですが、品質管理はしっかりしているとしか答えてくれなくなりました。

(無題) 削除/引用 No.1320-35 - 2009/10/14 (水) 03:15:03 - おお >[Re:27] APさんは書きました : > > おおさん質問にまだ答えていないですが、まずこのコメントへレスします（おおさん、横にそれてすみません） > > 「本気」氏のコメントは、私の書き込みに対する揚げ足とりに過ぎず、論証もしていないし、なにかしら有用な情報提供や論議をしようという意志が感じられないです。私のコメントに対する最初のレスも、いくら匿名掲示板とはいえ、あまりに失敬です。 > 「それは、どうしてそう結論したんですか、どのようなエビデンスがお持ちか」と問うならわかるし、まっとうな研究者、といわず普通の人間ならそうするんじゃないですか。 わたしも同感です。 科学的な議論もしようという姿勢も見られませんでした。 相手の書いていることもちゃんと読んでないような感じでしたし、 書き込みの一部をみて、言い掛かりをつけているようにしかみれません。

(無題) 削除/引用 No.1320-34 - 2009/10/14 (水) 03:08:13 - おお >[Re:28] 中年さんは書きました : > 抗ペプチド抗体の話なのであまり良い例ではないのかもしれませんが、リン酸化特異抗体を作るべくリン酸化ペプチドをKLHにコンジュゲートしてウサギに免疫したことが何度もあります。その際、精製前の血清を用いたELISAの段階で、リン酸化ペプチドに対するシグナルと非リン酸化ペプチドに対するシグナルの比は個体によって結構まちまちでした。同様なことをなさった方はどなたもご経験のことと思います。 なる程ありえそうなはなしです。 でもだから生物学はやめられないんだよなぁ 、、、あ、ひとりごとです。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1320-33 - 2009/10/14 (水) 03:04:34 - おお >[Re:30] APさんは書きました : > > 経験の話ではないですが、カタログでみてみましたら市販のcaspase抗体はペプチド抗体 and/or モノクローナル抗体がほとんどで、もともと単一のエピトープしか認識しないので、言っておられるようなことは起こらなそうですね。たまに完全長（あるいは部分長）タンパク質で免疫したポリクローナル抗体も少数ながらありますが、すべてIHC用とされていて、ウェスタンには推奨されていないみたいです。それでもあえてウェスタンをやった人がいると面白そうですが。 あ、売ってないのか、、全長で免疫したポリクロは、、、 カスペースが見つかった初期のペーパーで全長で免疫した 抗体使ったデーターを見たことがあるような気がしたのですが、 多分自前で作った抗体なんでしょうね、、、 あとペプチド抗体を使う方が品質管理がしやすいという意見 がありましたね。売ってる抗体でそういう例を探すという意味では 範囲が狭まるかもしれません.

(無題) 削除/引用 No.1320-32 - 2009/10/13 (火) 23:00:32 - RAM 私は抗体に精通した人間ではないですが、こちらのトピを非常に興味深く拝見させて頂いております。 抗体力価がlot間で違うことについて非常に素朴な疑問を抱きましたので、恥を覚悟で書かせて頂きます。 lotはAP様もこちらのトピで最初に書かれているように、免疫個体の区別です。 こちらのlot作製、つまりウサギへの免疫は通常同時期に行われるものなのでしょうか？ もっと言えば、クローズドの系統で同腹の兄弟のウサギで、同じ環境で飼育されており、免疫した時期も同時に行われるものなのでしょうか？ 私がこの疑問を持った背景をお話致しますと、確実な論文などの根拠がある訳ではないのディスカッションにもならないかもしれませんが、例えばヒトだと、季節で免疫力が上がったり下がったりしますよね？SPFマウスは完全に人工的な環境下で飼育されていますが、それでも何故か、季節によって妊娠しやすかったりするようです（これはあくまでも、実際に飼っている者としての感覚ですが）。 また、ストレスを感じると「免疫力（俗な言い方で申し訳ありません）」が下がると聞いたことがありますが、免疫されているウサギの飼育環境によって抗体のデキの良さが変わることはあり得るのでしょうか？抗体会社によって抗体の善し悪しの差ができるというのが以前から不思議でしたが、おお様のご意見通り抗原の精度はlot間の違いという点でそこまで重要ではないとすると、会社全体で違う過程の一つに、ウサギの飼育環境というのは考えられないものでしょうか。 ストレスの多い環境だと、役に立たないような変な抗体も作ってしまうようなことって、起き得ないことなのでしょうか? (ここにご意見を書かれている皆様から見ると、かなり初心者的な質問（ある意味、妄想）になってしまっている気がして大変恐縮ですが。。その場合は長文でディスカッションを中断してしまい申し訳ありませんでした。)

(無題) 削除/引用 No.1320-31 - 2009/10/13 (火) 13:49:05 - AP ちょっとした思考実験ですが、一種のタンパク質の異なるエピトープそれぞれに対する抗体の力価の強弱ではなくて、同時に複数類のタンパク質の混合物で免疫した場合はどうなるだろうと想像してみます（一種類のタンパク質であっても、免疫反応の中で結局は分解されてそれぞれ独立したエピトープになるわけですが）。 単一のタンパク質で免疫しても、ロットによって抗体ができていたり出来なかったり、力価や結合係数が違ったりということは起こります。そういうことは同時に免疫した複数のタンパク質に対して独立して起こるでしょうから、それぞれの抗原に対する相対的な力価が違うということは、当然起こるのではないでしょうか。 市販品の抗体は、モノクロ抗体、ペプチド抗体が多いですが、再現性の高いものを安定して供給するための選択なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1320-30 - 2009/10/13 (火) 13:07:30 - AP >2本見えたバンドについて、何か感触はありますか? >燐酸かのような修飾、スプライシングアイソフォーム >とか、、、、 その例では、どちらのバンドもとてもシャープでS/Nも良好で、強度もあまり変わりませんでした。共通に見えているのが約50 kDa、もう一つのほうが40 kDaくらいだったと記憶します（なにしろ初めて自前で抗体を作ったうちの一つで、古い記憶ですが）。 当時は新規のタンパク質でよくわからなかったのですが、今では分泌タンパク質で糖鎖修飾があることがわかっています。サイズの差や、あとからわかった事実から考えると、リン酸化の線はなさそう。あるとしたら糖鎖修飾のちがいかもしれないけれど、抗原が大腸菌で発現したものですから、そこを見分ける抗体ができる可能性は低そうです（たまたま糖鎖付加サイトがエピトープになっていて、糖鎖が付加されると認識できないととか、アクロバットでもない限り）。やはり一次構造そのものが違うというのが一番ありそうです。 mRNA/cDNA種が、一種類しか見つかっていないので、スプライスアイソフォームではないかもしれません。発現精製したタンパク質が自発的に決まった長さを生じるcleavageを起こしやすいということがあったので（これがまたウェスタンで検出された二本のバンドと同じようなサイズ差）、in vivoでも似たようなことが起こっているのかなとは想像しています。例えば、完全長のものとN末側が失われたタンパク質があって、N末側とC末側に独立したエピトープがあったとしたら説明がつくと考えています。 >[Re:16] おおさんは書きました : > > 例えばカスペースの全長から作った抗体。 > カスペースはプロセッシングでその複数のフラグメント > からなるアクティブなコンプレックスをつくります > (たしか30kDaくらいと10kDa強だったと、、)。 > > 同じサンプルをつかって、違うロットでこの2つの > サブユニットのシグナル強度の比がかわったとか > そういう経験、感触があるかたはいないかなぁと、、、 経験の話ではないですが、カタログでみてみましたら市販のcaspase抗体はペプチド抗体 and/or モノクローナル抗体がほとんどで、もともと単一のエピトープしか認識しないので、言っておられるようなことは起こらなそうですね。たまに完全長（あるいは部分長）タンパク質で免疫したポリクローナル抗体も少数ながらありますが、すべてIHC用とされていて、ウェスタンには推奨されていないみたいです。それでもあえてウェスタンをやった人がいると面白そうですが。

(無題) 削除/引用 No.1320-28 - 2009/10/13 (火) 12:53:53 - 中年 抗ペプチド抗体の話なのであまり良い例ではないのかもしれませんが、リン酸化特異抗体を作るべくリン酸化ペプチドをKLHにコンジュゲートしてウサギに免疫したことが何度もあります。その際、精製前の血清を用いたELISAの段階で、リン酸化ペプチドに対するシグナルと非リン酸化ペプチドに対するシグナルの比は個体によって結構まちまちでした。同様なことをなさった方はどなたもご経験のことと思います。 これは、同じ抗原の複数のエピトープに対して、個体ごとに違った比で抗体が出来ているということで、だとすればリコンビナントタンパク質に対するポリクロのロット毎に同様な違いがあるというのは大いにありそうなことだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1320-27 - 2009/10/13 (火) 12:22:40 - AP > >[Re:25] うさんは書きました : > > ＞ほかの書き込みにケチをつけるためだけのコメントはやめて、もっと建設的 > > おおさんも、どうも頭の中には「こういう答えがほしい」ってのがあるみたいに見え、 > > その思いにサポートが欲しいだけなら、そういってくれた方が気持ちよくなるコメントを > > 書き込む人は書いてくれるんではないですか？ おおさん質問にまだ答えていないですが、まずこのコメントへレスします（おおさん、横にそれてすみません） 「本気」氏のコメントは、私の書き込みに対する揚げ足とりに過ぎず、論証もしていないし、なにかしら有用な情報提供や論議をしようという意志が感じられないです。私のコメントに対する最初のレスも、いくら匿名掲示板とはいえ、あまりに失敬です。 「それは、どうしてそう結論したんですか、どのようなエビデンスがお持ちか」と問うならわかるし、まっとうな研究者、といわず普通の人間ならそうするんじゃないですか。 科学の世界ですから、別の見解を戦わせるのは建設的なことですが、「本気」はそれとは明らかにちがう行為です。ここの利用者は皆さん、紳士的ですからなにもいわないでしょうけれど、一連の幼稚な書き込みは失笑を買っていることでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1320-26 - 2009/10/13 (火) 09:11:05 - おお >[Re:25] うさんは書きました : > ＞ほかの書き込みにケチをつけるためだけのコメントはやめて、もっと建設的 > おおさんも、どうも頭の中には「こういう答えがほしい」ってのがあるみたいに見え、 > その思いにサポートが欲しいだけなら、そういってくれた方が気持ちよくなるコメントを > 書き込む人は書いてくれるんではないですか？ あ、そうみえますか、、、、 ま、実際に近い実験をして、全然うまくいかなかった からやめた方がいいとかいう意見でもいいと思っては いますが、、、 抗体にのノンスペがあるよという指摘も、では私の考えている 系や、抗体が反応する領域とそうでない領域を考えるうえに置いて、 どう処理していったらいいかとか書いてくれるとうれしいのですけどね、、、

(無題) 削除/引用 No.1320-25 - 2009/10/13 (火) 08:57:11 - う ＞ほかの書き込みにケチをつけるためだけのコメントはやめて、もっと建設的にいきましょうよ。 別の意見が、ケチをつけるためだけのコメントというのであれば、賛同しかしません。 おおさんも、どうも頭の中には「こういう答えがほしい」ってのがあるみたいに見え、 その思いにサポートが欲しいだけなら、そういってくれた方が気持ちよくなるコメントを 書き込む人は書いてくれるんではないですか？

(無題) 削除/引用 No.1320-24 - 2009/10/13 (火) 07:19:41 - おお >[Re:23] 笑い男さんは書きました : > 　その抗体を使ったデータを信用して良いのかどうか？ってことですよね。 > > 今回はポリクロってこともあるので、論文の信頼度は△かな〜、私は100％信じて実験を進めるのには躊躇するかも・・・ たしかにそうですね。そういうところに落ち着きますね。 多分実験計画を立てて、バッチとか同じロットを実験が 終わるまで十分な量買ったり、ロットが変わるところで チェックを入れて把握することが必要になってくるでしょうね。 しかし対象が何処の領域か分からないけど、フラグメント でしかもそも混合物となると、、、工夫しないとロット間 のチェックもできないなあってもおもいます。 でたのグループのデーターは参考にするが絶対でないと 思わないと仕方がないですね。

わたしもこの意見かな〜 削除/引用 No.1320-23 - 2009/10/13 (火) 01:56:36 - 笑い男 　その抗体を使ったデータを信用して良いのかどうか？ってことですよね。 今回はポリクロってこともあるので、論文の信頼度は△かな〜、私は100％信じて実験を進めるのには躊躇するかも・・・です。こんな意見しか出せないです・・・申し訳ありません。 　メーカーに抗体の保障項目？検査項目？なんかを問い合わせてみませんか？販売している以上は、何らかの検査をパスしているはずだと考えて、どんなチェックをして販売しているのでしょうか？っと聞いてみて、ご自身の懸念を確認するのが一つの手かと思います。 　つまらない意見ですが、各抗体メーカーがどのようなチェック態勢で販売しているのかが気になるところです。 >[Re:11] あいうさんは書きました : > ロットが違っても同じようにいきそうな気がしますが、 > 自分がレビュワーだったら、ロット間の反応性の差について > 指摘しますね。 >[Re:10] おおさんは書きました : > でたしかに抗原せいのない部分は拾えない可能性があるのですが、 > それはこの系を使う限り仕方がないとして、購入している抗体 > のロットや同じ会社でも違う研究グループでやっているデーター > をどのように考慮して、実験するのがいいかと思っているわけです。 >[Re:9] おおさんは書きました : > 他のグループが、260アミノ酸で免疫した売っている抗体 > を使って、ここの部分は反応しなかったということを > ある論文で出しています。 > > 同社の違うロットの抗体で、そのデーターがどこまで再現 > があるかと言う事が気になっているわけです。

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