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(無題) 削除/引用 No.132-6 - 2009/03/05 (木) 13:39:15 - 名無し 20μg/laneということなので蛋白質量は,極端に存在量の少ない特別な蛋白質でない限りは,WBで見るにはじゅうぶんのように思います。もしミニゲルを使用されているならば、むしろすこし多過ぎくらいの量です。ですから蛋白質量が少なくてという可能性は低いように思いました。それで、まずはそれ以外の要因、とくにWBのテクニカルなことからまず検討した方がいいような気がします。転写とかは膜をポンソーあるいはCBBで染色するとちゃんといけてるかどうかわかります。tubulinは脳をはじめどこでもあるので、転写、他の組織（細胞）のサンプルをレーン流せば１次、２次抗体、ECLが大丈夫かどうかわかりますね。サンプル調製についての注意は既にでているいろんなアドバイスを参考に再検討してみましょう。いまよりは何か改善が見られると思います。

膵臓からの蛋白抽出 削除/引用 No.132-5 - 2009/03/05 (木) 12:45:48 - nao 数々のご丁寧なご返答ありがとうございます。 蛋白の濃度はBCA法で行い、2.5μg/μlでした。 泳動量は20μg流しております。 今回のご意見を踏まえて再度実験を行いたいと思います。 ※知識不足な質問で申し訳ございませんでした。

(無題) 削除/引用 No.132-4 - 2009/03/04 (水) 22:50:04 - りょう 質問者さんの「やはり、組織量が少ないのでしょうか。」という問いには何とも答え方に困ってしまいますね。 泳動した蛋白量・一次抗体（anti-tubulinと言えど）など検出系、あなたの腕など「組織量」を考える前にクリアにしないといけない部分が多すぎます。 膵臓は消化酵素が豊富なので、泳動した量が少なければ、それに含まれるtubulin量が予想以上に少なくなり検出効率が悪くなる恐れがあります。 そういった元々のコンテントの問題に加えて当然分解による量的減少も考えられます。 また、アミラーゼの分子量はtubulinのそれと同じくらいなのでblot効率・膜上での検出効率が低下する可能性も否定できません。 cm2ってcm3じゃないのも疑問ですし、おそらく組織量ウンヌンを問われているというのは蛋白濃度を測定されていないのでしょうね。 もうちょっとマトモな実験をされるべきだと思います。 検討違いでしたら失礼。

(無題) 削除/引用 No.132-3 - 2009/03/04 (水) 19:22:05 - 名無し ねずみとかの動物のすい臓だとちっちゃいですね。電気泳動の前に蛋白質濃度は測定していますか。薄すぎるようならホモジナイズのとき、組織重量に対するlysis buffer量を考える必要があるかもしれないですね。すい臓はいろんな加水分解酵素の前駆体が詰っていて、死ぬとそういうのが活性化すると思うので、イメージ的に死後変化が他の組織よりも急速ではげしそうな気がします。だから屠殺して時間がたつと生化学的な解析には適さないようにも感じますので、できるならば、と殺したら即摘出して、フリーザーに一時保存とかせず、すぐにホモジナイズに移した方がいいような感じがします。 すい臓のトリプシンが気になるならトリプシンインヒビターをたくさん入れることができるでしょう。あと大丈夫とは思いますがエンテロキナーゼのある十二指腸の部分は混じらないように注意した方がいいですね。それでもどうもプロテアーゼがなんか働いてしまってどうもーーーという感じなら、組織をプロテアーゼインヒビターを含むSDSサンプルバッファー（２−４％SDS)中で直接ホモジナイズするとかもいいかもしれないです。それから超音波してそのあと20Cくらいで遠心してS/Nを回収して蛋白質濃度定量したら即、−８０Cに保存という感じで。この方法はどうしても細胞質だけみたいというときは使えないけど。 これとは別に、見たい蛋白質がいまやってる方法でほんとに抽出できるものなのかどうかは確かめる必要があるでしょう。上述の方法はほぼ全蛋白質を回収できるので、そういう意味で利点はあるかもしれないです。 あとチューブリンのほうもイマイチということなので２次抗体の品質とかECLの期限とか装置大丈夫かとかwestern blotting関係一般の方も一応OKかどうか確認したほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.132-2 - 2009/03/04 (水) 18:36:07 - EcoRI >用途としては細胞質の蛋白抽出をしております。 界面活性剤を検討する必要があると思います。 Triton-Xとか >やはり、組織量が少ないのでしょうか。 この可能性は大いに有ると思います。 >また膵臓から蛋白抽出をおこなうと、トリプシンなどの消化酵素で蛋白が壊れてしまうものなのでしょうか。 DTTとインヒビターを効かせて、４℃で処理しているので、分解は抑えられているのではないかと。

膵臓からの蛋白抽出 削除/引用 No.132-1 - 2009/03/04 (水) 18:22:19 - nao 膵臓から蛋白抽出を行いました。 �@0.5％NP40Lisis Buffer1ｍｌに以下の分量を混ぜます。 　1MDTT　1μl 　0.1MNa3VO3　10μl 　100×Protease Inhibitor　10μl 　100ｍM　PMSF　10μl �Aその中に4ｃ�uくらいの大きさの組織を�@に入れ、ホモジナイズします。 �B4℃30分回転させながら混合 �C4℃10分15000rpmで遠心 �D上清を新しいチューブに移して-80℃に保存 上記の方法で蛋白抽出をしてウェスタンブロットを行ったのですが、 αーチューブリンも薄っすらバンドがでるくらいで、目的のバンドも薄いためあまり良い結果がでません。 用途としては細胞質の蛋白抽出をしております。 やはり、組織量が少ないのでしょうか。 また膵臓から蛋白抽出をおこなうと、トリプシンなどの消化酵素で蛋白が壊れてしまうものなのでしょうか。

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