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(無題) 削除/引用 No.1313-9 - 2009/10/13 (火) 23:19:10 - natu 種によって違うので一概に言えないところです． 展開した葉でも難しいこともあります． サンプルに頂芽そのものを使ってみるのはどうでしょう． 植物種がなにかわかりませんが， まだ展開しきっていない葉を含む芽を何個か集めれば 抽出に十分な量になるのではないかと思います． 細胞密度が高く，若い組織だととれやすいので， 本葉が一対出たくらいの芽や花芽(蕾)などもいいかもしれません．

CTAB 削除/引用 No.1313-8 - 2009/10/10 (土) 13:42:32 - 植物屋 CTABは長らく使ってませんが、 多糖が多いサンプルでは、抽出後に酢酸ナトリウムで多糖を落とすというステップを加えます。 具体的には、final 0.3M NaOACにして、氷上で30min静置し、遠心後の上清を別のチューブに回収してエタ沈。 です。

(無題) 削除/引用 No.1313-7 - 2009/10/09 (金) 21:45:21 - flower natuさん ありがとうございます。 Nucleon PhytoPureは前のラボで使っていたんですが、今は特にキットを使わず、マニュアル的にCTAB法で抽出をしています。やはり、キットを使ったほうが今の私のやり方よりも高品質なDNAが回収できるのでしょうか。Nucleon PhytoPureは手順も楽ですし。茶褐色のresinが効率よく多糖を吸着してくれたと思います。泳動した際にバンドを検出できなかったという結果からDNAは抽出できていないと判断すべきでしょうか。泳動写真はスメアも何も無いまっさらな状態です。 また上司に報告したら他のやり方(SDS法)はどうかといわれました。ですが、上司はあまりDNAに関しては詳しくないです。これに関してはやったことがありませんのでよくわかりませんが、CTABに変わる方法として試してみる価値はありそうでしょうか。Nucleon PhytoPureの抽出原理の基本はSDS法のようなのでやってみてもいいかな、、という気もしていますがいかがでしょうか。。 現在抽出対象としている植物は比較的多糖が多いと思います。おっしゃるとおり、いかに多糖を除去するかが鍵だと思います。葉のサンプリングに関しては、頂芽から見て、１〜２段くらい下の葉を取っています。下位葉は基本的に使ってないです。 いかがでしょうか、結構行き詰っているので、相談に乗っていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.1313-6 - 2009/10/09 (金) 18:31:30 - natu まず，植物のゲノムDNAは普通の電気泳動(0.8％アガロース/TAEなど)で検出できます． サイズはラムダDNAと大体同じくらいの位置にでます． 分光光度計だと細かい断片やRNAが同じピークとして出てしまうので， むしろラムダDNAの蛍光と比較した方が正確な濃度が見積もれると思います． 葉緑体DNAのコンタミ量についてははっきりとはわかりませんが， 後のサザン分析の結果から予測すると大部分が核ゲノムDNAのように思います． ゲノムDNAの抽出は実は植物種や組織によって難易度がかなり違います． エタ沈時に見えるゼリー状のものはおそらく多糖類でしょう． 抽出過程で多糖類をいかに除くかが植物DNA抽出の鍵で， 植物だとDNA抽出がRNA抽出より難しいケースもあります． まずサンプルはできるだけ若い葉芽や花芽から取ることを推奨します． あとは，キットがたくさん出ているのでいろいろと試してみるのも手でしょう． タイプの違うキットを3つ紹介しておきます． Nucleon PhytoPure Plant DNAZol Qiagen DNeasy

(無題) 削除/引用 No.1313-5 - 2009/10/08 (木) 23:23:52 - ザンギ オルガネラのゲノムって、核ゲノムと比べて１細胞あたりのコピー数が何ケタも多いですよね？

(無題) 削除/引用 No.1313-4 - 2009/10/08 (木) 16:00:33 - flower ザンギ様 ご返信ありがとうございます。 私自身のサザンの経験から、DNAをそのまま泳動しバンドを確認したことが あったので、今回何もバンドが得られなかったのはどうしてかと悩んでおりました。 ゲノムDNAはサイズが大きすぎるから確認できない、でもオルガネラはゲノムDNAに比べてサイズは小さいからバンドとして検出できることもある、、、とう解釈でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1313-3 - 2009/10/08 (木) 14:57:40 - ザンギ ゲノムＤＮＡをそのまま電気泳動してもバンドは見えないと思うけど．．． それってオルガネラゲノムじゃないですか？ それから、エチブロとカメラがあればサランラップの上にのせてＵＶ当てれば、 ある程度定量できると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1313-2 - 2009/10/08 (木) 11:44:00 - とおりすがる 結構植物種によって取れやすさ、きれいになりやすさに違いはあるので、過去同じような植物での方法があったらトレースしたほうが早いかもしれません。 DNAが取れているかどうかは、その後のアプリケーションによって変わると思います。大量に必要ならPCRで検出できるレベルではあっても意味はないかもしれませんし。

植物葉からのDNA抽出について 削除/引用 No.1313-1 - 2009/10/08 (木) 08:46:51 - flower いつもお世話になっております。先日CTAB法を用いて植物（花）葉からDNA抽出を行いました。 抽出終了後、DNAを定量するために抽出DNAをそのまま泳動したのですが、バンドを何も検出することができませんでした。スメアのようなものも何もなく、とにかくまっさらです。 抽出植物自体は割と多糖が多いと思われるものですが、磨砕後、HEPES、PVP、メルカプトエタを含む洗浄液で２回ほど洗っています。 以前別の植物で抽出をして行って泳動したときははっきりとバンドが得られたので、試験手順にそこまで誤りがあるとは考えづらいのですが。 エタ沈したときの状態は８サンプル中一つは、黄色みがかったペレット、その他は特にペレットというわけではなく、ドロッとした緑がかった透明のゼリー？状のものが沈殿していました。 エタ沈産物の状態から考えて、しっかりと抽出ができていないと考えた方がよいのでしょうか。 また、今回抽出したものにDNAが含まれているかどうかを判断するにはどうしたらよいでしょうか。私の研究室は分光高度計が無いので、泳動して定量するのが限界なのですが、結果的にこれでもバンドが得られなかったので、何か一つランダムプライマーを用いて低TmでPCRを行い、増幅産物が得られたら沈殿物を視認できなかったけどもDNAが抽出できていると判断しようと思うのですが、こういったアプローチの仕方はあまり一般的ではないでしょうか。 皆さんのご意見を伺えたらと思います。

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