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(無題) 削除/引用 No.1304-10 - 2009/10/11 (日) 00:18:44 - Tb あべちゃんさん、PDIさん、情報ありがとうございます。 PDIさんのお話しですと、FBSは単純にいい、わるいというよりも不確定要素となりうるということですね。 さて、あれから私も10% FBS DMEM vs. Opti-MEM IでPEI transfectionを293Tで比較してみました。PEIはPolysciences社のPEI"MAX"です。GFP発現ベクターをいれて、FACSで評価しました。複数のDNA/complex量（比は前にoptimizationで選んだ1:4 (ug)に固定）でしました。結果、10% FBS DMEM下でもserum-free Opti-MEM I下でもほぼ同じ効率でした。 ------------ ところで、先に、293TでPEIはベストなトランスフェクション試薬ではなかったと書きましたが、正確に言うとその時使った細胞は293T由来のレトロウイルスパッケージング細胞Plat-Eでした。今回はClontechからのLenti-X 293Tという細胞を使いました。Plat-EでのPEIの効率に関する結論は間違ってないと思うのですが、今回はClontech 293Tでは、細胞障害がほとんどない上に予想以上のGFP% & GFP MFIがえられ、おそらくTransIt-293と同等になるのではという手応えでした（ただしDNA量はPEIの方が2倍多く必要のようです）。本当に個々の細胞で入る・入らないの性質は違うものだなぁと思いました。もう少し調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1304-9 - 2009/10/08 (木) 11:03:56 - PDI lipofectamineのケースですが、FCSのLotを変えたところ血清存在下では全く遺伝子導入が出来なくなりました。 細胞を疑って試行錯誤しましたが、結局は無血清培地（Opti-MEM）で実施したら見事に発現しました。 コンプレックス形成時はもちろんですが、トランスフェクション（3h程度）時も無血清培地で実施するプロトコルに統一しております。

(無題) 削除/引用 No.1304-8 - 2009/10/08 (木) 08:00:32 - あべちゃん >[Re:7] Tbさんは書きました : > 私も293T細胞を使ってPEImaxでトランスフェクションの最適化の条件検討と市販試薬との比較をしたことがあるのですが、その時はPEImaxはTransIt293という試薬より少し劣ると結論しました。しかし、10% FBS DMEMの培地を使っていたため、あべちゃんさんの話を聞くと、もう一度血清なしでも試さなくてはいけないのかな、と。。。 可能性はあるかと思いますがPEImaxやTransIt293という試薬を使用した経験がありませんので、はっきりとは言えません。 言うとすれば、トピ主さんがおっしゃっている自作PEIでは、血清感受性で血清無添加DMEM条件で遺伝子導入効率がかなり向上し、OPTI-MEMのほうがさらに数十％ほど向上するというのが、私自身が昔、条件検討した時の結論です。

(無題) 削除/引用 No.1304-7 - 2009/10/08 (木) 01:53:24 - Tb あべちゃんさん、便乗質問させてください。 > PEIは血清にかなり影響を受けると思います。 培地に血清あり／なしでどれくらい差があるかわかりますか？ GFP%とかウイルスタイターの差とかで。Web検索で出てくるPEIトランスフェクションプロトコルでは血清があってもいいように書いてあるので、血清の影響はないのだと思いこんでいました。 私も293T細胞を使ってPEImaxでトランスフェクションの最適化の条件検討と市販試薬との比較をしたことがあるのですが、その時はPEImaxはTransIt293という試薬より少し劣ると結論しました。しかし、10% FBS DMEMの培地を使っていたため、あべちゃんさんの話を聞くと、もう一度血清なしでも試さなくてはいけないのかな、と。。。

(無題) 削除/引用 No.1304-6 - 2009/10/07 (水) 14:42:28 - ごんべい あべちゃんさん、非常に参考になりました。 早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.1304-5 - 2009/10/07 (水) 14:10:54 - あべちゃん >[Re:4] ごんべいさんは書きました : > 多分過去トピでPEI溶液はもちが悪いようなことがあったような気がしますが、4度での保存はどれくらいを目安にしているのでしょうか？ 去年の7月中旬に作製したPEIがずっと4度で保管されたままですが、今年の9月末に使用した時に問題なかったです。 > また、トランスフェクション時の細胞の密度はおおよそどれくらいがよいでしょうか？ 一般的なトランスフェクション技術と同じで、コンフにならない少し手前くらいで行っています。

(無題) 削除/引用 No.1304-4 - 2009/10/07 (水) 13:36:32 - ごんべい あべちゃんさん、Eireさん、貴重なご意見をありがとうございました。 DNA/PEIを希釈は等張付近であればあまりうるさい注文はなさそうですね。PBSでも良いくらいでしょうか。 血清が影響をするとのことですのでトランスフェクション時はOPTI-MEM等無血清培地に買えておいた方が良いと言うことですね。大変参考になりました。 多分過去トピでPEI溶液はもちが悪いようなことがあったような気がしますが、4度での保存はどれくらいを目安にしているのでしょうか？ また、トランスフェクション時の細胞の密度はおおよそどれくらいがよいでしょうか？ 質問を増やしてしまって申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いします。

中和して使っています 削除/引用 No.1304-3 - 2009/10/07 (水) 09:45:11 - Eire PEI Max の水溶液はそのままでは酸性 (うろ覚えですが、確か pH 4 位だったと思います）なので、私は 1M NaOH で pH7.5 になるように中和しました。その後フィルター滅菌し、直ちに使う分は 1.5 ml エッペンチューブに取り４度保存、残りは 15 ml プラスチック遠心管に分注しマイナス２０度保存をしています。 また、DNA/PEI 希釈液にはフィルター滅菌した 0.15 M NaCl を使っています。トランスフェクション効率に問題が生じたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.1304-2 - 2009/10/07 (水) 09:38:28 - あべちゃん >[Re:1] ごんべいさんは書きました : > 過去トピで皆様が絶賛していらっしゃるPEI 適応できない細胞もあるので、私はHEK293やHEK293由来のウイルスPackaging cellにしか利用していません。HeLaに対する毒性はLipofectamin>PEI>Fugeneという感触を持っています。 >PEI-Maxを水で1mg/mlに調製するようなのですが、この時この溶液は中和するのでしょうか？ 水酸化ナトリウムでpH7.4に合わせています。 >また、DNA/PEIを希釈するHBSSに入っていてはいけない（または入っていなくてはいけない）ものはありますか（MgCl2, Cacl2, MgSo4, phenol red等)？ご経験のある方是非、ご伝授ください。 私はHBSSではなくOPTI-MEMを使用しています。あと、最近、血清が入っていてもOKなlipofection 試薬が多いですが、PEIは血清にかなり影響を受けると思います。なので、培地もOPTI-MEMを好んで使用しています。

PEIトランスフェクション 削除/引用 No.1304-1 - 2009/10/06 (火) 21:26:31 - ごんべい 過去トピで皆様が絶賛していらっしゃるPEIを用いたトランスフェクションを試してみようと思いPolyethylenimine “Max”を購入しました。いざ、ためさんと思った所で疑問が生じました。PEI-Maxを水で1mg/mlに調製するようなのですが、この時この溶液は中和するのでしょうか？また、DNA/PEIを希釈するHBSSに入っていてはいけない（または入っていなくてはいけない）ものはありますか（MgCl2, Cacl2, MgSo4, phenol red等)？ご経験のある方是非、ご伝授ください。

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