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CJサマ 削除/引用 No.1299-5 - 2009/10/22 (木) 16:08:47 - t3 ご指導ありがとうございます。 tween20を0.3％加えることで若干青色系に補正されました。 濃度を変えたり、Triton-Xにしてみたりと さらに微調整を重ねてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1299-4 - 2009/10/16 (金) 20:04:09 - CJ > 還元が足りないとありますが、 > BCIPの脱リン酸化されたものとNBTとの反応が進んでないということですか？ NBT/BCIPの反応産物は3種類あって、はじめのものがピンク色でエタノールや界面活性剤に可溶性です。反応が進んだ最終産物は暗い青色でこれは有機溶媒に不溶です。たしかロシュのプロダクトシートにそのような情報があったような。 > その対処法が界面活性剤んの添加となっていますが、 > 界面活性剤に還元作用があるのですか？？ 弱い作用があるそうです。よわーい還元剤（ＤＡＢＣＯとか）が同様に有効らしいです。強い還元剤（例えばホルマリン）だと反応が一気に進んで試料が真っ青になります（経験あり）。 > 最後に、界面活性剤が含まれていると経験上 > シグナルが時間の経過とともに落ちていくと思うのですが > 発色液に加えても0.3％くらいならちょうどいい感じになるのでか？ > 界面活性剤の濃度が高いとシグナルがちょっとにじんだ感じになります。 0.5％位でも大丈夫だと思います。

CJサマ 削除/引用 No.1299-3 - 2009/10/14 (水) 20:16:41 - t3 リアクション遅くなりましてすみません！ 助言ありがとうございます 早速今週のやつから試してみようと思います 少し質問させて下さい。 還元が足りないとありますが、 BCIPの脱リン酸化されたものとNBTとの反応が進んでないということですか？ その対処法が界面活性剤んの添加となっていますが、 界面活性剤に還元作用があるのですか？？ 最後に、界面活性剤が含まれていると経験上 シグナルが時間の経過とともに落ちていくと思うのですが 発色液に加えても0.3％くらいならちょうどいい感じになるのでか？ お時間あるときに またご返答いただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.1299-2 - 2009/10/08 (木) 14:49:09 - CJ 還元が足らんのです。 反応液に0.3%程度Tween 20を入れてみてください。

WIHSの発色の色について 削除/引用 No.1299-1 - 2009/10/06 (火) 10:23:46 - t3 こんにちは 私は、マウス胚の生殖腺を用いてWISHをしています。 既知のポジコンになるような遺伝子で予想道理の部分が染まるので 実験系自体は問題ないと思うのですが発色の色が… という状態で困っています。 DIGをかませたプローブを用い、アルカリフォスファターゼのついたDIG抗体と反応させて、発色液にはRocheのNBT/BCIP tabletを溶かして使っています。 この試薬での反応では普通、青もしくは青紫っぽい色になるはずなのですが すごく赤っぽい色になってしまいます。 なぜでしょうか…。 一番影響がありそうなのは発色反応の前のpHを合わせるところかな と思っているのですが、NTMTはきちんと毎回直前に調整してるので フレッシュな状態を保っていると思うし。うーん。 発色→固定後に短時間1%Triton-X/PBSにさらして 青っぽく軌道修正したりもしていますが 根本的な要因がわかればありがたいなと思っています。

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