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プレートの洗浄 削除/引用 No.1298-6 - 2009/10/29 (木) 20:17:43 - 名無し コーティングの後の0.05% Tween20入りPBSでの洗浄はよくないように思います． 自分で感度が悪くなり痛い目に遭いましたし，nuncのカタログにもそのように記載されています（後で気づきました）． 本筋から外れているかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1298-5 - 2009/10/07 (水) 05:48:35 - おお ポリクロが、コートされたモノクロを強く認識しているような、、、 ブロッキングに血清とか使って改善する? 選んだコンビネーションが悪かったかなぁとはおもえますが。

(無題) 削除/引用 No.1298-4 - 2009/10/06 (火) 09:06:12 - makky7 コメントありがとうございます。 抗体類は市販品で、コーティングに使用したものはR&D Systems、発色に使用したものはSanta Cruzから購入しました。 コーティングにR&Dを選んだのは、この会社が測ろうとしているサイトカインのELISAキットも販売していたからです。Santa Cruzは安価だったからです。 ご指摘の通り、抗原特異性が気になったので、念のためにウェスタンブロットで抗原特異性は確認しました。ただ、両者の抗体を別々に使用していますので、エピトープの認識における競合についてはわかりません。 書き忘れたのですが、コーティングのときの抗体濃度が低いほど、吸光度が低くなる傾向があります。この現象は、標準液の濃度が低濃度のとき（0〜50 ng/mL）に顕著でした。 なので、今度はコーティングの抗体濃度をゼロにしたらどうなるかなど、確認してみようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.1298-3 - 2009/10/06 (火) 05:47:45 - ~ モノクロ、ポリクロ作成時の抗原は確認しましたか？

(無題) 削除/引用 No.1298-2 - 2009/10/05 (月) 23:00:12 - test ポリクロの中に、モノクロのエピトープ近傍を低い親和性で認識するものがあるからじゃないですかね。

サンドイッチELISAなのに競合法のような濃度-吸光度曲線になる 削除/引用 No.1298-1 - 2009/10/05 (月) 22:09:33 - makky7 いつも勉強させていただいております。 細胞培養上清中のサイトカインを測定するためのサンドイッチELISA系の自作を試みています。 まだ条件検討中でして、コーティング用および発色用の抗体の濃度と、ブロッキングのＢＳＡの濃度などを振って、標準サイトカイン蛋白を用いて手頃な検量線が描けることを目指しています。 コーティングはモノクロの抗体、発色は一次抗体自体にHRPラベルしてあるポリクローナル抗体を使用した直説法による発色をしております。 コーティングは、pH 7.4のPBSでもpH 9.0の炭酸バッファーでもほとんど違いがなかったので、PBSで行っています。 全体的なノンスペが高いため、ブロッキングは4% BSA入りPBSで行い、抗体およびサンプル希釈液も4% BSAで行っています。 もちろん、コーティング、ブロッキング、サンプル添加、発色用抗体添加の各段階の間は、0.05% Tween20入りPBSで３〜８回洗浄しております。 さて、これまでサンドイッチ法でELISA系を作ってきまして、いくつか濃度を振るだけで割とうまくいっていたのですが、今回は予期せぬことが解決できずに困っております。 と言いますのは、サンドイッチ法なのにもかかわらず、標準サイトカインの4% BSA入りPBS中の濃度が０のときの吸光度が最も高く、濃度が上がるたびに吸光度は低くなるという、まさに競合法と同じような濃度-吸光度曲線を描くのです。 本当に0〜200 ng/mLの間でキレイな曲線を描くので、このまま本実験に持っていってもよいくらいなのですが、いかんせん、サンドイッチ法なのにこのような曲線になることの説明が出来ず、困っております。 各段階の間ではよく洗浄しているので、目的のサイトカインと抗体とが競合反応するとは思えません。 いったい、どのような現象が起こっていると考えられますでしょうか？

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