全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1291-10 - 2009/10/09 (金) 09:11:19 - ats > > 溶出させて得た産物は中和されており、抗原抗体複合物になっているから、あとで行うELISAで発色してしまうのですよね。・・・なのでproteinAで吸着させると抗原も結合画分に行きそうな気がします。 > 他の方のご意見などみますと、結局、ProteinA(G)で抗体のみ吸着させることは可能なのでしょうか？ これは、無理だと思います。 抗原に対して混入している抗体が微量という前提で、多少抗原はロスしますが、proteinAもしくはELISAで使用するものと同じ二次抗体で問題の一次抗体を吸収してしまえば良いのでは、と思いました。

(無題) 削除/引用 No.1291-9 - 2009/10/08 (木) 22:48:33 - ルキア > 出来上がりのカラムはGlycine-HCl(pH2.5)で洗っていますか？　２回目の使用でもそうならたぶんだめですが。比率の問題なので、多少そのコンタミがあっても何とかなる場合もあると思いますけど。 洗っています。また、電気泳動の結果は、本当に綺麗なんです。ただ、いざ、抗原に利用すると、ブランクも色づいてるのが分かります・・。 比率の問題ということは、ELISAの条件を少しいじって、目立ちにくくさせれば良いと言うことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1291-8 - 2009/10/08 (木) 22:45:46 - ルキア 皆様、いろいろと回答いただき、ありがとうございます。 > 溶出させて得た産物は中和されており、抗原抗体複合物になっているから、あとで行うELISAで発色してしまうのですよね。・・・なのでproteinAで吸着させると抗原も結合画分に行きそうな気がします。 他の方のご意見などみますと、結局、ProteinA(G)で抗体のみ吸着させることは可能なのでしょうか？ > 溶出産物を高濃度の還元剤で処理してIgGの高次構造を壊すのはいかがでしょう。 たとえば、どの程度の還元剤をどれくらいの濃度でやってみると良いでしょうか？保証できないのは重々、承知しておりますので、参考程度で構いません（＾＾;）

(無題) 削除/引用 No.1291-7 - 2009/10/05 (月) 06:55:09 - おお 単に感度がよくって見ないでもいいまで見てるようなきがしますが、、、 逆にアフィニティーかけてからイオン交換というてでもいいかもしれません。 また、アフィニティー後にもう一度イオン交換とか。 そもそも、ELISAの抗原ならもう少し効率のいい発現系をお使いになっては どうかと思うのですが、、、、、バクテリアとか、バキュロなど、、、 確かに効率以外に考えないといけないパラメーターがないとは言えませんが

(無題) 削除/引用 No.1291-6 - 2009/10/04 (日) 20:52:01 - a 方法を変えたた法がいいかも.GST-tag? SDS-PAGE gelから切り出すのはどう?変性しててもいいのでしょう?

(無題) 削除/引用 No.1291-5 - 2009/10/04 (日) 19:41:18 - c どんな場合でもカップリングが100%というわけにはいかないから、どうしても架橋しそこなったものは溶出時に漏れます。先に指摘があるようにカップリング後少し強い条件でサッと洗うことである程度は洗い流せます。ただやり過ぎると抗体に良くないので注意しましょう。終わったらすみやかに普通のbufferに戻すことが大切です。 これもすでに指摘がありますが、今持っている溶出画分をprotein AまたはGで吸収するということも良いと思います。ただマウスモノクローナル抗体ならばprotein Gを使って下さい。どうしてもprotein Aでないとという場合はpHを上げて高塩濃度でおこなわないと付きにくいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1291-4 - 2009/10/04 (日) 19:02:41 - コロ 出来上がりのカラムはGlycine-HCl(pH2.5)で洗っていますか？　２回目の使用でもそうならたぶんだめですが。比率の問題なので、多少そのコンタミがあっても何とかなる場合もあると思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1291-3 - 2009/10/04 (日) 18:11:00 - み >[Re:2] atsさんは書きました : > 抗体をproteinA（二次抗体）カラムで吸収するのはダメですか。 溶出させて得た産物は中和されており、抗原抗体複合物になっているから、あとで行うELISAで発色してしまうのですよね。・・・なのでproteinAで吸着させると抗原も結合画分に行きそうな気がします。 溶出産物を高濃度の還元剤で処理してIgGの高次構造を壊すのはいかがでしょう。その産物をELISA-plateに固相化して、よくwashしてblocking、1次抗体の流れ。実際やったことないので上手くいくかは保証できませぬ。

(無題) 削除/引用 No.1291-2 - 2009/10/04 (日) 10:36:57 - ats 抗体をproteinA（二次抗体）カラムで吸収するのはダメですか。

固定化したリガンドの漏れ（アフィニティーカラム） 削除/引用 No.1291-1 - 2009/10/04 (日) 07:32:57 - ルキア いつも勉強させていただいております。 現在、ＥＬＩＳＡの抗原として利用したい、あるホルモン（糖タンパク質）の精製を行っています。 その方法として、動物細胞でタンパク発現させた目的ホルモンを、イオン交換カラム後、 そのモノクローナル抗体をカップリングさせて固定した、アフィニティーカラム（Formyl-CellulofineというCNBrの改良版みたいなもの）を用いており、0.1M Glycine-HCl(pH2.5)で溶出させています（その後、中和）。 溶出画分をSDS-PAGE（銀染色）で確認しますと、不純物がほとんど見られないので、 ＥＬＩＳＡの抗原として利用できる！と思ったのですが、、、、 いざ、作製した抗原をＥＬＩＳＡに利用し、サンプル（抗体）の抗体価を見てみますと、ブランクにも呈色が見られ、 どうやら、カップリングさせたモノクローナル抗体がごくごく微量に漏れてきてしまっているようです。 この漏れを何とかしてなくしたいのですが、溶出条件を緩くさせたりすれば良いのでしょうか？（どのように？） ＥＬＩＳＡ自体が最初にプレートに固定化する抗原濃度は0.6μg/mLで、1次抗体（サンプル）が0.05μg/mLから1/2希釈を行っており、 かなり高感度なので、ごく微量でもカラムから漏れたリガンド（抗体）を検出してしまっているようですが、 何とかさせたいと思っています。 少しでもアドバイスいただければと思います。宜しくお願い致します。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---