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(無題) 削除/引用 No.1290-12 - 2009/10/06 (火) 21:54:06 - A 便乗質問ですが、免疫染色して電顕で観察とかできないものでしょうか。 私は実習程度しか電顕を扱ったことがないのでこの実験の目的に対して どれぐらい実現性があるのかわかりませんが、その辺りに詳しい方が いらっしゃったら今後のためにご意見頂けませんか。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1290-11 - 2009/10/06 (火) 20:43:42 - chick 皆様ありがとうございます。 質問の方法からあいまいで申し訳ございませんでした。それにも関らずたくさんのご回答・ご指摘を頂き感謝しております。 まず、使用している抗体についてですが、標的となるタンパク質にＧＳＴのタグをつけていますので一時抗体に抗ＧＳＴを使用しています。二次抗体には蛍光色素をつけたIgGです。 標的タンパク発現のためのベクターにはシグナルペプチド、膜貫通ドメイン共に存在しています。分泌タンパクではありません。ゴルジ体・小胞体のことは考慮しておりませんでした。 FACSを考えておりましたが、細胞分画法や、cell maskを使った染色等は勉強不足でした。

(無題) 削除/引用 No.1290-9 - 2009/10/06 (火) 17:17:08 - 千夏 とりあえず細胞質の外側に発現するように作ったものは細胞外の部分をepitopeとするのを前提として、cell maskで形質膜を染めた上で標的タンパク質と二重染色してみるというのはどうでしょう？cell maskより内側、外側って感じで染色されませんかね？いや、推測ですがｗ

(無題) 削除/引用 No.1290-8 - 2009/10/06 (火) 10:22:28 - あべちゃん 顕微鏡実験にとらわれず、細胞分画法も検討されてはどうでしょうか？ Proteinase Kを利用すれば少なくとも膜表在蛋白質かどうかは判定できそうですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1290-7 - 2009/10/06 (火) 10:19:19 - み chickさんの質問の仕方だと、まともな事が何も見えてこないのです。 抗体は蛋白のどの部分を認識するものでしょう？ 蛋白は外に出る可能性をおっしゃっていますが、膜貫通ドメインが存在するのでしょうか？分泌蛋白でしょうか？外に出るものでも合成過程のものはゴルジ・小胞での観察がされると思います。この辺りも考慮されているのでしょうか？ コンストラクションですが、外に出るというものはシグナル配列が存在しているのでしょうか？ 染色による判定だけでなく、細胞分画など他の手法でも検討可能でしょう。 っという具合に疑問点が山積なのです。 ネット上での意見をもとに、それを正しく理解して、マトモな手法で実験できるのか、この質問に関してはかなり疑問です（回答者側も状況が把握できていません）。

(無題) 削除/引用 No.1290-6 - 2009/10/06 (火) 08:49:05 - ザンギ かなり疑問の残る質問の仕方かと思います。 答えを得たければ、みさんの指摘されているようなことにひとうひとつ対 応していかないとね。 細胞表面タンパク質のマーカー抗体をポジコンにして、「外側」に発現させ たつもりの細胞をＰＦＡで固定して、できればＦＡＣＳで半定量的に蛍光強 度を測定して、同じ条件で「内側」のつもりの細胞を染めてみればある程度 は物を言えるんではないかと思いますが、いかがでしょうか。 もうちょっとやるならトリプシンで消化するとシグナルがどうなるとか。

おおさん・・・ 削除/引用 No.1290-5 - 2009/10/06 (火) 00:30:57 - chick ご回答、ご指摘ありがとうございます。 ＰＬＰ固定は腫瘍マーカーの染色に使うものとばかり思っていましたので、考えてもいませんでした。 　　やはり、染色過程による人為的ダメージと、私自身が思い込みによって画像を判断してる部分が多いかもしれないです。 どのようにすれば、標的タンパク質が設計したベクターどおりに発現しているかを確認できるのだろうといろいろ調べているのですがいまだにはっきりした方法を見つけられていない状態です。 細胞膜の外側に発現していることの確認はやはり難しいでしょうか？ どなたか知恵を貸していただけるとありがたいです。

みさん 削除/引用 No.1290-4 - 2009/10/06 (火) 00:12:47 - chick みさん ご指摘ありがとうございました。　おっしゃるとおり、問題は山積みです。

(無題) 削除/引用 No.1290-3 - 2009/10/05 (月) 06:40:38 - おお PFA固定は細胞膜透過処理をせずに細胞ないのものを染める プロトコールも見たことがあるので、PFA固定して透過処理 あるなしで細胞内、外のものを染分けたとして皆さんどの 程度信用されるか興味があるところです(もちろんターゲット 材料によって違うのでしょうけど)。 かつてアクチンが細胞外に突き出ているというデーター を話題にしているのを聞いたことがあります(これについては PFA固定したか分かりません). 微妙な固定の解釈と実際に起こっていることのギャップにより データーの捉え方が左右されることがまあまああるのかなぁ とも思えます。 どなたか、以前の書き込みで細胞をPBSで洗った程度の未固定で １次抗体処理をしてから固定したというプロトコールを紹介して いたのを見たことがあるような気がします。 あと固定方法としてPLP固定というのがあるそうです。糖もクロスリンク され、細胞膜上のタンパクが透過処理により流れにくいそうです。 細胞ないに染まっている場合、局在も見ておくべきかもしれません。 発現したものがゴルジやERに蓄積して細胞表面に出てきてないかも しれませんし。 たしかに何かポジコンは欲しいところですね。でもポジコンでベストな 条件があなたの蛋白にベストかどうか分からないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.1290-2 - 2009/10/04 (日) 00:43:21 - み 問題山積みですね。 PFA固定では穴あきません。 開いて染まったとしたら、染色過程での人為的なダメージによるものでしょう。 やりたいことがよく分らない。またそれが科学的にまともなことか不明。 染色操作に問題ないか不明。 作成されたコンストラクトが理にかなっているかどうかも不明。 固定すると染まったとのことですが、そのシグナルの特異性も不明。

標的蛋白質の確認 削除/引用 No.1290-1 - 2009/10/04 (日) 00:09:40 - chick いつも参考にさせていただいています。　培養細胞を使ったアッセイをし始めたばかりですが、このフォーラムでいつも勉強させていただいています。 今行なっている実験方法についてお聞きしたいことがあります。 細胞質膜の外側と、内側（細胞質）に標的蛋白質を発現するようにベクターをそれぞれ作製しました。そのベクターがきちんと標的蛋白質を発現しているかを調べるために、蛍光免疫染色を行なっています。設計したベクターをHela細胞にトランスフェクションし、4％パラホルムアルデヒド-リン酸バッファ-で固定した場合と固定をしていない場合で比較して細胞膜外側か内側かを観察しようとしています。固定した場合に染まり、未固定で染まらなければ、細胞膜内側であるという結果を出したいと考えております。細胞膜透過処理は行なっていませんが、パラホルムアルデヒドで細胞膜がダメージをうけるので、固定することにより抗体が細胞膜の内側に入っていくだろうと考えております。 この条件で実験をしましたら、細胞膜外側に発現するように設計したベクターも、細胞膜内側に発現するよう設計したベクターも両方とも未固定で染色されず、固定すると染色されました。これは、ベクタ-設計が上手くいっておらず、両方とも細胞膜内側に発現していると考えてもよいのでしょうか？ポジコンがありませんので確認できませんが、手技上に問題点があるのでしょうか？ どなたかご教授いただければ幸いです。

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