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この場合 削除/引用 No.1288-4 - 2009/10/05 (月) 11:41:08 - MK GFPは新しく抗体つけて染色する必要あるんですか？ CD31染色が未固定でうまくいくのだったら、 CD31のみの染色を行って、GFPは抗体つけずに それ自体を励起させればいいと思うのですが？

さとさん 削除/引用 No.1288-3 - 2009/10/04 (日) 11:13:55 - マウス さとさん アドバイスありがとうございます。 現在、 一次抗体は 　rabbit anti-GFP Abcam (ab290) x2000 　rat anti-mCD31 Acris (BM4086) x400 二次抗体は 　donkey anti-rabbit -Alexa488 Mol Pro(A21206) x1000 goat anti-rat -Cy3 Jackson Immun (112-166-003) x200 で行なっております。 blocking追加と希釈倍率の変更してみます。

(無題) 削除/引用 No.1288-2 - 2009/10/03 (土) 19:45:25 - さとくん 確かに、固定をするとCD31のノンスペ染色が多く出るのが少々気になりますが・・・。 10%ヤギ血清でブロッキングをする前に一度３〜５％のBSA入りPBSで３０分程度ブロッキングしてみたらどうでしょうか？あるいは、二次抗体（donkeyの方）の希釈倍率を下げてみたり、goatの二次抗体の希釈倍率を上げてみたりしたらどうでしょうか？現在、二次抗体の希釈倍率はどのくらいで行っていますか？

GFPとCD31の2重染色についておしえてください 削除/引用 No.1288-1 - 2009/10/03 (土) 13:57:22 - マウス いつもお世話になっています。 初歩的な質問で申し訳ありません。 マウスの肺に静注したＧＦＰ発現細胞の分布（特に血管との関係を）を 蛍光２重染色（ＧＦＰ, rabbitAb，mＣＤ３１, ratAb）で 検討しておりますが、 ＧＦＰ染色（2次抗体-ＡＬＥＸＡ４８８, donkeyAb）が弱く、 ＣＤ３１（2次抗体-Ｃｙ３, goatAb）は非特異的染色が多く出ます （血管も染色されていますが）。 こちらの方法は 組織採取後、以下の順で行っています クラボーfinefix(4%parafolmardehideの代わり)4度 30分 １０％sucrose o/n ＯＣＴ包埋 ８uMクリオスタット 風乾15分 ＰＢＳ tween 10分2回 ＰＢＳ tritonX 5分2回 ＰＢＳ洗浄5分3回 10%ヤギ血清（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ）30分 1次抗体　o/n ＰＢＳ洗浄5分3回 2次抗体 ＰＢＳ洗浄5分3回 改善点がわからず困っております。 気になる点は �@ＧＦＰ（細胞内）を染めるために固定をしていますが 　未固定と比べて明らかにＣＤ３１の非特異的染色が 　多く出ていること 　 �A抗体希釈液、ブロッキングをすべてヤギ血清で行なっているところ 　ＧＦＰの２次抗体がdonkey由来なので、donkey血清も使うべき？ �Bfinefix(4%parafolmardehideの代わり)4度 30分が短すぎる？ などありますがよくわかりません。 御指導宜しくお願いいたします

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