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(無題) 削除/引用 No.1287-6 - 2009/10/06 (火) 09:46:59 - コロ シグナル配列が壊れていない可能性が高いと思います。この場合N末端側にタグを残してアンカーする形になると思います。 シグナル配列が壊れていなければ、そのまま分泌されるが、タグなしになるでしょう。目的からするともっともやってはいけないデザインですね。

(無題) 削除/引用 No.1287-5 - 2009/10/03 (土) 14:58:09 - AP >そのタンパクはN末にシグナル配列が付いており、細胞内でそれがプロテアーゼで切断され、それで細胞外へ分泌されますが、私はその興味ある遺伝子から作られる全長のタンパクのN末側にタグを持ってきてしまいました。 教科書的には、N末のシグナルペプチド（20 aa程度の疎水性リッチなストレッチ）は、翻訳中のペプチドがERに進入するのに必要です。ERへの進入はN末のシグナルペプチドが合成された時点で始まり、ある程度進入した時点で切り離されますが、それに続くペプチドは合成されるはしからERに取り込まれます。ER内に取り込まれたタンパク質は、糖鎖修飾を受けたり、そこから小胞輸送系にのって、分泌されたり、膜タンパク質なら細胞膜にインテグレートしたりします。 N末端が即、疎水性のストレッチになっていないなら、ER内にペプチドが取り込まれるということが起こらないわけです。なので、分泌されないだけでなく、本来受けるべき糖鎖修飾もシグナルペプチドの切断も起こりえません（もしシグナルの切断が起こるとしても、同時にタグが外れてしまうので役に立たなくなるわけですが）。 もし、目的の実験が、mature form（シグナル切断済み）である必要も、糖鎖修飾済みの必要もないなら、細胞質タンパク質として発現されたタンパク質を生成するという方法もあるとは思います。

(無題) 削除/引用 No.1287-3 - 2009/10/03 (土) 14:19:30 - あ だめ。つくりなおし。 過去にも投稿があったと思う。

(無題) 削除/引用 No.1287-2 - 2009/10/03 (土) 14:02:18 - おお ダメっぽいです、、、、、 コンストラクトを具体的に見てみないと断言できませんが、、、、

ほ乳類細胞でのタンパク質発現系 削除/引用 No.1287-1 - 2009/10/03 (土) 13:05:06 - HEK293T みなさまお世話になります。 このたび、興味ある遺伝子から作られるタンパクをFc融合タンパクとしてHEK293Tに発現させ、Protein Aカラムで精製してこようと考えております。 このHEK293Tは血清フリーに馴化しており、この融合タンパクは生理的には分泌タンパクとして細胞外に放出されます。 私の不勉強のため、コンストラクションが終わったここにきてひとつの疑問が生じました。 そのタンパクはN末にシグナル配列が付いており、細胞内でそれがプロテアーゼで切断され、それで細胞外へ分泌されますが、私はその興味ある遺伝子から作られる全長のタンパクのN末側にタグを持ってきてしまいました。 この場合、シグナル配列がCapされるので、シグナル配列として機能しなくなってしまうのではないか？ つまり、細胞外へも分泌されないのではと危惧しております。 なぜ私がこのように考えたかというと、私の同僚がC末にKDEL配列を持つタンパクを扱っており、そのKDEL配列の更にC末にタグを入れると小胞体retentionシグナルとして機能しなくなるというようなネガコンとしてコンストラクトを作成していたからです。 みなさまにお聞きしたいのは、N末に分泌タンパクのシグナル配列がある場合、その更にN末にタグを付けておくと、その配列はシグナル配列として機能しなくなる、というのは分泌タンパクの世界ではコンセンサスになっておられるのでしょうか？ということと、コンストラクションの段階でタグを挿入する場合、シグナル配列があるN末を避け、C末に挿入すべきだったのか、をみなさまの経験豊富なアドバイスを頂けますと幸甚です。 どうか、よろしくお願いいたしますm(__)m

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