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Percollによる内皮細胞分離 トピック削除
No.1261-TOPIC - 2009/09/29 (火) 09:50:45 - すや
Perfusion法によってマウス肝臓から血管内皮細胞を分離している初心者なのですが、よく論文でPercollの密度遠心勾配で25%/50%の中間層を回収するという手順があります。
それにのっとって実験をしてみたのですが、25%と50%の中間層になかなかバンドが出てこなく、25%のfractionのなかにブロードになって出てきます。
25%, 50% Percollの作り方はHBSSにPercoll溶液(GEヘルスケアから購入)を3:1、1:1の比率で混ぜて50%、25%の順に重層しているのですが何か問題点等あるのでしょうか？

アドバイスの方、宜しくお願いします。
　
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No.1261-10 - 2009/09/29 (火) 23:58:06 - TS
私は50mlのFalconに30%,50%,80% パーコールをそれぞれ5mlずつ重層して分離層を作製しています。

その上に細胞懸濁液1〜2mLをゆっくりと加えた後、遠心をします。

遠心の条件は2500rpm,4℃,30minsです。

(無題) 削除/引用
No.1261-9 - 2009/09/29 (火) 20:08:08 - すや
よっしーさんへ

返信ありがとうございます。
早速試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.1261-8 - 2009/09/29 (火) 19:37:02 - よっしー
> 室温でした方がよいんでしょうか？
> 遠心の条件は適当な論文を参考にしただけです。

参考にした論文が4度でしているなら，4度でいいと思います．

> あと50% Percollに細胞を懸濁した方がいいということですが、細胞を下層においてもきちんと分離する（中間層に現れる）のでしょうか？

はい．私はサンプルによって上からいったり，下からいったりしています．

(無題) 削除/引用
No.1261-7 - 2009/09/29 (火) 19:01:13 - すや
室温でした方がよいんでしょうか？
遠心の条件は適当な論文を参考にしただけです。
（うちの研究室には誰も専門の方がいないのでとりあえずしてみたという感じです）

あと50% Percollに細胞を懸濁した方がいいということですが、細胞を下層においてもきちんと分離する（中間層に現れる）のでしょうか？
私が密度勾配遠心の原理が良く分かっていないと思うのですが、イメージとして下層にある場合、遠心のGがかかっているために下層より上の中間層に細胞が集まらないと思うのですが・・・。

(無題) 削除/引用
No.1261-6 - 2009/09/29 (火) 18:25:01 - よっしー
> （ちなみに今は50mLファルコンに50% Percoll 10mL、25% Percoll 10mL、細胞懸濁液5mLを載せて2500rpm,25min,4℃で行っていますが、かなり適当かと思います）

細胞を50%percollに懸濁させたほうがきれいにいきそうな気がします．
ブレーキもオフにしてね．
液量は細胞数にもよるでしょうが，そんなものでいいのじゃないでしょうか．
7mLと7mLにして15mLのチューブのほうが回収率は良いかもしれませんが．
でも4度でほんとにいいのですか？

(無題) 削除/引用
No.1261-5 - 2009/09/29 (火) 17:15:26 - すや
皆様、アドバイスありがとうございます。
Percoll溶液に塩が入っていないことは知りませんでした。

Percoll溶液と1.5M NaCl=9:1を100%原液にして実験してみます。
あと、使用するFalcon（15mL or 50mL）、重層するvolumeはどのくらいが良いのでしょうか？

論文を読んでいても細かい条件は載っていないので教えてください。
（ちなみに今は50mLファルコンに50% Percoll 10mL、25% Percoll 10mL、細胞懸濁液5mLを載せて2500rpm,25min,4℃で行っていますが、かなり適当かと思います）

何度も申し訳ありませんが宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.1261-4 - 2009/09/29 (火) 12:42:00 - TS
私は細胞内原虫をPercollで分離しています。

Percoll:1.5M NaCl = 9:1で原液を作製し、
この原液を100%と考えて1×PBSで希釈してやると上手くいくと思います。
（例えば、50%パーコール液は原液：1×PBS=50:50です。）

この手法で細胞は30%と50%の間に綺麗な層を形成しますよ。

(無題) 削除/引用
No.1261-3 - 2009/09/29 (火) 12:01:51 - よっしー
TK-1さんの仰るとおりですね．
さらに，密度は温度によって変わりますよね．

http:// 削除/引用
No.1261-2 - 2009/09/29 (火) 10:30:37 - TK-1
Percollの原液って塩が入ってないから、1XHBSSと混ぜたらどうなるんでしょうね？

Percollによる内皮細胞分離 削除/引用
No.1261-1 - 2009/09/29 (火) 09:50:45 - すや
Perfusion法によってマウス肝臓から血管内皮細胞を分離している初心者なのですが、よく論文でPercollの密度遠心勾配で25%/50%の中間層を回収するという手順があります。
それにのっとって実験をしてみたのですが、25%と50%の中間層になかなかバンドが出てこなく、25%のfractionのなかにブロードになって出てきます。
25%, 50% Percollの作り方はHBSSにPercoll溶液(GEヘルスケアから購入)を3:1、1:1の比率で混ぜて50%、25%の順に重層しているのですが何か問題点等あるのでしょうか？

アドバイスの方、宜しくお願いします。
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