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(無題) 削除/引用 No.1260-6 - 2009/09/29 (火) 23:35:51 - HYK Pumpkin様 > あんまりバリアントにこだわっているわけでも、バリアントに違いないという盲信でもないんですが、DBにないからバリアントでないということにはならないですよね。新たなバリアントかもしれません（サンプルが通常のサイズのmRNAが出ているものであれば、いくつかのバンドが出なければおかしいのでしょうが）。 そうでよね。おっしゃる通りだと思います。 現在、増えたバンドをクローニング中です。（なかなか入ってくれないですが） バリアントかどうかはシークエンスをして確かめてみます、 > 失礼いたしました。私もバシッと増えてノンスペという経験はないので、バリアントも考えてはどうかなっとおもったところです。あとは、deletionしやすいような配列がないかどうかでしょうか。いまさらですが、クローニングってcDNAをクローニングしているんですよね（バリアントって言っているからそうでしょうけど）？ クローニングはHeLa細胞の逆転写産物をtemplateにしています。cDNAです。 何種類かtempalteを試した方がいいのかもしれませんが、現在保有しているのがそれだけなので。 > 私も~様と同様にこれまでいくつかのGCリッチなプロモーターを取ってきましたが(最高80%)、トピ主さんと同様の経験はありませんね。ある種のGNリピートとかは欠失しやすいとされています。ただ、700塩基となるとこれまたガボッとないなぁという印象はありますね。やっぱりサザン（僕なら）。でもサザンしているうちにシークエンス出来る環境ならシークエンスでしょうね。 私の今クローニングしようとしているものもGC含量が80%くらいです。 GCリピートには欠損しやすいものもあるのですね。参考になります。 とりあえず、ベクターに入ったら配列読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.1260-5 - 2009/09/29 (火) 17:33:21 - Pumpkin >スプライシングバリアントの報告はあるのですが、私がPCRで増やした大きさのバリアントはない あんまりバリアントにこだわっているわけでも、バリアントに違いないという盲信でもないんですが、DBにないからバリアントでないということにはならないですよね。新たなバリアントかもしれません（サンプルが通常のサイズのmRNAが出ているものであれば、いくつかのバンドが出なければおかしいのでしょうが）。 >もちろんDMSOを添加することによるノンスペバンドの出現は心得ております 失礼いたしました。私もバシッと増えてノンスペという経験はないので、バリアントも考えてはどうかなっとおもったところです。あとは、deletionしやすいような配列がないかどうかでしょうか。いまさらですが、クローニングってcDNAをクローニングしているんですよね（バリアントって言っているからそうでしょうけど）？ 私も~様と同様にこれまでいくつかのGCリッチなプロモーターを取ってきましたが(最高80%)、トピ主さんと同様の経験はありませんね。ある種のGNリピートとかは欠失しやすいとされています。ただ、700塩基となるとこれまたガボッとないなぁという印象はありますね。やっぱりサザン（僕なら）。でもサザンしているうちにシークエンス出来る環境ならシークエンスでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1260-4 - 2009/09/29 (火) 12:29:44 - HYK Pumpkin様 > スプライスバリアントが報告されていないだけで、実はある可能性をざっくり捨ててしまえるほど根拠があってのご判断でしょうか？ すいません。間違えていました。 スプライシングバリアントの報告はあるのですが、私がPCRで増やした大きさのバリアントはないということです。 > >DMSOを用いてPCR > > これは常套テクニックですが、それによってnon-specificが増えるということもご理解しておられますか。 もちろんDMSOを添加することによるノンスペバンドの出現は心得ております。私はここ数年DMSOを使用してクローニングを行っています。もちろんノンスペも出ることもありますが、specificにバンドがバシッと出ることの方が多いです。今回も後者なので、少し不安を覚えたという次第です。 ~様 > プロモーターのクローニングを1,2個した時には、そのような大きな変化は見られませんでした。 やはり関係ないのでしょうか。。。ノンスペの可能性高いですね。 > ライゲーション用に精製したフラグメントを、no cut, 2 cutなどしてから泳動してみてはいかがでしょうか。 > 2~3時間で、PCRバッファーなどによる移動度の変化と、期待しないフラグメントが増えているという2つの可能性を消せると思います。 そうですね。その方法は簡単にできるのでしてみようと思います。 クローニングを終えたらシークエンスでも確かめてみます。 > ところで、3000と3700はどのくらいの精度で見ているのでしょうか？ > λ/HindIIIの2.3kbと4.4kbの間の微妙な違いを過大評価していませんか？ 市販されているマーカーを用いています。（1kbラダー） これまで3000~4000bpくらいの遺伝子のクローニングも多々やってきており、その時は目的のものが4000bpならマーカーも4000bp、目的のものが3500bpならマーカーの3000bpと4000bpの間、といった感じでかなり精度は高かったイメージです。 クローニングしつつ、ノンスペの可能性を考慮して、再度PCRをかけてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1260-3 - 2009/09/29 (火) 10:46:05 - ~ プロモーターのクローニングを1,2個した時には、そのような大きな変化は見られませんでした。 ライゲーション用に精製したフラグメントを、no cut, 2 cutなどしてから泳動してみてはいかがでしょうか。 2~3時間で、PCRバッファーなどによる移動度の変化と、期待しないフラグメントが増えているという2つの可能性を消せると思います。 ところで、3000と3700はどのくらいの精度で見ているのでしょうか？ λ/HindIIIの2.3kbと4.4kbの間の微妙な違いを過大評価していませんか？

(無題) 削除/引用 No.1260-2 - 2009/09/29 (火) 10:05:03 - Pumpkin >ちなみにスプライシングバリアントはない スプライスバリアントが報告されていないだけで、実はある可能性をざっくり捨ててしまえるほど根拠があってのご判断でしょうか？ >DMSOを用いてPCR これは常套テクニックですが、それによってnon-specificが増えるということもご理解しておられますか。その増えた断片が目的とされるものであるかを確認すればよいことだと思います。一部の配列はPCR増幅が容易でしょうから、それでサザンしてみるとか、トピ主さんもおっしゃるようにシークエンスするとかで次の手立てが考えられると思います。シークエンスの結果、スプライスバリアントが見つかったという話はよくあることです。

GCリッチなPCR産物の電気泳動 削除/引用 No.1260-1 - 2009/09/29 (火) 00:06:20 - HYK いつも大変参考にさせております。 現在、GCリッチなある遺伝子（human）をクローニングしており、当フォーラムでもよく紹介されているようにDMSOを用いてPCRを行い、フラグメントが増えたのですが、電気泳動を行うと目的のサイズ（3700bp）よりもかなり下になってしまいました（約3000bp）。私は今までクローニングしてきて、こういう現象は初めてだったので、非常にとまどっております。GCリッチな遺伝子ではよくあることなのでしょうか？今後ベクターに組み込み、シークエンスする予定ではありますが、皆さんの経験談などを聞かせていただけると、非常にうれしいです。 ちなみにスプライシングバリアントはないみたいです。 宜しくお願いします。

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