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細胞内サイトカイン測定 トピック削除
No.1259-TOPIC - 2009/09/28 (月) 23:01:53 - なおき
細胞内サイトカイン測定で2点程質問です。

PBMCをFicollで取ってきて測定の時まで凍結しています。
まず、抗原刺激の前に（解凍後）37度でovernight置いておいた方が良いという記載をしている論文が2報ほどありましたが、皆様実際にはどれぐらいの時間37度でincubateされていますでしょうか？12時間とか24時間とか検討された方がいらっしゃれば教えていただければ幸いです。Reviewには6時間は少なくとも置いた方が良いと記載があります。現実的には6時間ぐらいにして朝に解かすか、18時間ぐらいにして前日夕方に解かすかという選択肢になるかとは思っています。
次に、抗体で染める時の温度ですが、室温と4度としているプロトコールがあるようです。IFN-γ PEと通常のCD3、CD4、CD8の抗体を使っていますが、その組み合わせに限らず室温と4度を比較した方がいらっしゃれば差があるか教えていただければ幸いです。Tetramerは37度が良いという論文に一応従っていますが、細胞内サイトカインで比較したような論文が見つけられませんでした。
宜しくお願いいたします。
　
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No.1259-6 - 2009/09/30 (水) 15:51:39 - なおき
御意見ありがとうございます。
Apoptotic cellを除去した方が良いことは最近の総説にも書いてありますね。抗体反応の温度については4℃でそのまま行っていこうと思います。
こちらの研究室では抗原刺激後のIncubateを少し長い目に取っているので解凍後のIncubateする時間は8時間にして朝から夕方までとしようと考えています。
情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1259-5 - 2009/09/30 (水) 13:13:37 - FACS
培養や刺激後はFCS/SSCゲートでリンパ球や単球が本来あるべき所にあっても
PIやInvitrogenのLIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kitsで染めるとけっこう死細胞がいたりして、非特異的な染色の原因になるので、私は必ず使用しています。使用していないpaperも多々ありますが。。。
BDのCytoperm/Cytofixで細胞膜に穴を開けて固定後にPIで染めると全ての細胞が染まります。Invitrogenのものは固定後でも生細胞と死細胞を区別できると謳っています。ただ私はCytoperm/Cytofix前にいつも染めているので確認はしていません。
FACSの抗体やサイトカインの抗体で４℃以外で使用するものは個人的にはあまり聞いたことがありません。
ご事情があるようですが、条件をなるべく一定にするために、刺激前に３７℃でincubateする時間はすべてのサンプルで一定にするのがよいのではないでしょうか？

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No.1259-4 - 2009/09/29 (火) 19:49:13 - １１
うる覚えですが、以前細胞内サイトカインを測定している人が
PIを使用したとき、全てがPI陽性になったと言ってた気がします。

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No.1259-3 - 2009/09/29 (火) 15:51:46 - なおき
御意見ありがとうございます。
確かに凍結保存をしない方が望ましいとは思いますが、FACSの予約の関係やsampleが届く日時がまちまちであることから、凍結保存したsampleで行っています。
温度に関しては他に特に御意見がないようでしたら、これまで4℃でしていましたので、そのままで行っていこうかと思います。
後、一つ追加で質問ですが、細胞内サイトカイン測定時にPIを使っても問題ないでしょうか？細胞膜が壊れていると取り込まれるので細胞内サイトカイン測定で膜透過処理をした場合には染まるとか聞いたことがあるのですが。

(無題) 削除/引用
No.1259-2 - 2009/09/29 (火) 06:51:23 - FACS
私はいつもフレッシュなPBMCや腸管粘膜から取ってきたLPMCでICCSをやっています。凍結保存しておいた細胞ではやったことがありません。。。
抗体を染める際は、まずDeadCellStainingKitかPIで染めて、次にCD4等の表面マーカー、固定後に目的のサイトカインで染めています。いずれも能書通りに4℃でやっています。
凍結保存しておくと少しずつ細胞が死んでいくので、保存期間や条件によって結果がぶれると思うのですが。。。

細胞内サイトカイン測定 削除/引用
No.1259-1 - 2009/09/28 (月) 23:01:53 - なおき
細胞内サイトカイン測定で2点程質問です。

PBMCをFicollで取ってきて測定の時まで凍結しています。
まず、抗原刺激の前に（解凍後）37度でovernight置いておいた方が良いという記載をしている論文が2報ほどありましたが、皆様実際にはどれぐらいの時間37度でincubateされていますでしょうか？12時間とか24時間とか検討された方がいらっしゃれば教えていただければ幸いです。Reviewには6時間は少なくとも置いた方が良いと記載があります。現実的には6時間ぐらいにして朝に解かすか、18時間ぐらいにして前日夕方に解かすかという選択肢になるかとは思っています。
次に、抗体で染める時の温度ですが、室温と4度としているプロトコールがあるようです。IFN-γ PEと通常のCD3、CD4、CD8の抗体を使っていますが、その組み合わせに限らず室温と4度を比較した方がいらっしゃれば差があるか教えていただければ幸いです。Tetramerは37度が良いという論文に一応従っていますが、細胞内サイトカインで比較したような論文が見つけられませんでした。
宜しくお願いいたします。
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