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芳香環を持たないペプチドの定量法 トピック削除
No.1256-TOPIC - 2009/09/28 (月) 19:27:42 - mo
芳香環を持たないペプチドの定量法を調べていると、

ug/ml=144×A215/A225

という式を見つけました。ただ、この式はタンパク質濃度（ug/ml)を求める場合に用いられるようです。

私は5残基の芳香環を含まないペプチドを用いているのですが、上の式は芳香環を含まない短いペプチドの場合にも適用できるのでしょうか。

もし他の芳香環を持たないペプチドの定量方法をご存知でしたらご教授願います。
　
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(無題) 削除/引用
No.1256-6 - 2009/10/04 (日) 18:32:12 - mo
返信が遅くなって申し訳ありません。
皆様ありがとうございます。
皆様からご指摘いただいた点に注意して210nm付近の吸収を用いた定量を行ってみます。おお様に示していただいた論文はネットからはとれなさそうなので、どこかの図書館で探してます。
また、あまりに結果がばらつくようなら、ε値のわかっているものの修飾も試してみようと思います。
しかし、ペプチドの正確な定量は難しいようですね…。

(無題) 削除/引用
No.1256-5 - 2009/09/30 (水) 05:31:59 - おお
ttp://iai.asm.org/cgi/reprint/61/7/2991.pdf
(A215- A225) x 144 = protein concentration (micrograms per
milliliter) (18)

これじゃないですか?
少し式がちがいますけど、比を取るよりはこっちの方が
普通に感じます。A225をベースラインにしてA215の吸収で
見積もるということだと思います。

A215はペプチド結合の吸収です。280より感度がよく、
芳香族アミノ酸の数に作用されないのですが、このあたりの
吸収は比較的いろんなものがもっていると思いますので、
アドバイスがすでにありますように、気をつけないといけない
かとおもいます。示しました論文はメソッドとしてしたの
文献を引用してますね。

手に入るならぜひ見ておくべきではないでしょうか。
カレントプロトコールにもたしかこのてのことは
載ってたような気がします。

18. Waddell, W. J. 1956. A simple ultraviolet spectrophotometric
method for the determination of protein. J. Lab. Clin. Med.
48:311-314.

ん、古いだろうと思っていたけど、むっちゃ古いなぁ、、、

(無題) 削除/引用
No.1256-4 - 2009/09/30 (水) 00:20:38 - ザンギ
N末端が修飾されてなければ、α−アミノ基を定量すればいいんじゃないでしょうか。
ニンヒドリン反応だっけ？

化学修飾で発色団をつくったり、吸光係数の分かってるモノをつけたり、他にも色々ありそうだけど、ちゃんとやりたいならそれなりのスキルが必要だと思いますが。

210nmとか215nmとかの短い波長域は夾雑物の吸収が多くて使いにくいので、参考程度にしかみませんよね。

(無題) 削除/引用
No.1256-3 - 2009/09/29 (火) 23:52:52 - A
ペプチドマッピング時にHPLCで断片を分離する際には214nmを良く用います。
この波長は私の勘違いでなければペプチド結合に由来する吸光だったはずです。
moさんが示されている式に関しては知りませんが、検出するべき5残基の
芳香環を含まないペプチドが既にわかっているのであれば、それを合成して
214nmで検量線を引けばサンプル中のペプチドの定量ができるはずです。

(無題) 削除/引用
No.1256-2 - 2009/09/29 (火) 00:40:44 - c
ペプチド結合に由来する210nm付近の吸収波長を使うことがあります。たぶんこの式もそれに関連するものと思います。この付近の波長になると蛋白質ペプチド以外にもきょう雑成分などいろんなものが引っかかってくる可能性が多いので、正しいブランクをとるなど注意が必要です。どのくらいの精度を求めるかは実験目的にもによりますが、微妙なところだと微細なゴミとかセルの汚れも無視できないですし、濃度が比較的低い場合は同じサンプルでもかなり値がばらついてしまうこともあります。他にも方法はいくつかあったと思いますが非常に古典的な方法なので最近はもうほとんど行われていないとおもいます。20~30年くらい前の古めの生化学実験書が意外と役に立つかもしれません。

芳香環を持たないペプチドの定量法 削除/引用
No.1256-1 - 2009/09/28 (月) 19:27:42 - mo
芳香環を持たないペプチドの定量法を調べていると、

ug/ml=144×A215/A225

という式を見つけました。ただ、この式はタンパク質濃度（ug/ml)を求める場合に用いられるようです。

私は5残基の芳香環を含まないペプチドを用いているのですが、上の式は芳香環を含まない短いペプチドの場合にも適用できるのでしょうか。

もし他の芳香環を持たないペプチドの定量方法をご存知でしたらご教授願います。
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