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細胞内シグナル経路系の実験手法について質問です。 トピック削除
No.1251-TOPIC - 2009/09/28 (月) 13:03:48 - ppp
あるシグナル経路の実験の計画をしております。
過去の実験からタンパクAで細胞を刺激すると細胞内でタンパクB→タンパクCというシグナルが伝わります。
私は『タンパクB→タンパクC』の経路がタンパクDによって仲介されているかどうかをこれから調べようとしています。
この場合、タンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を用いてタンパクCの発現を確認するといった感じなのでしょうか。
また、その場合は『細胞にタンパクBの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクDの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を入れる場合』の条件でタンパクCの発現を確認するのでしょうか。
そしてこの実験はどのような実験手法が良いでしょうか(例えばWBやPCRなど)
すごい初歩的な質問で恐縮ですが、どなたか教えてください!!
 
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No.1251-5 - 2009/09/30 (水) 16:35:42 - S
阻害剤の濃度ですが、各阻害剤によって異なります。阻害剤の説明書に出ている濃度、さらには、論文で多く使われている濃度を参考に各種条件を振ってみるべきです。急がば回れが、こういうときは良いと思います。私の場合は論文に出ている濃度よりも高い濃度を必ず一点いれて検討しております。処理時間も降ってみる必要がありますが、それは論文で使われている時間を参考にすると良いと思います。参考までに。

(無題) 削除/引用
No.1251-4 - 2009/09/28 (月) 13:31:23 - ppp
ご回答ありがとうございます。
おかげで最低限の条件は理解できました。
あと、阻害剤の濃度や処理時間は論文に載っていたのですが、この論文に記載されているAの濃度が、私が過去に行った実験のAの濃度と異なります。
この場合、BやDの阻害剤の濃度はどのようにするべきでしょうか。
ちなみに論文ではBは10μM、Dは40μMとなっていました。
0.1μM、1μM、10μMという風に値を変えてそれぞれ実験をすればいいのでしょうか(Bの阻害剤の場合)。
値を変えたり、処理時間を変えたりして条件を探っていくのがどうもどの程度やればいいのか分かりません。

(無題) 削除/引用
No.1251-3 - 2009/09/28 (月) 13:13:43 - TS
いろいろ考えられているようですので、ご自分で組み立てられそうですが。

最低限必要なのは、次の3つだと思います。
・AでB, D, Cへの影響が確認できること
・Dの阻害剤でCへの影響(発現?)が止まり、Bへの影響は止まらないこと
・Bの阻害剤でD, Cへの影響が止まること

WBが良いか、PCRが良いかは、どんな変化を追っているか、で決められたら良いのではないでしょうか?

発現・・・PCRかWB
リン酸化など・・・WB

(無題) 削除/引用
No.1251-2 - 2009/09/28 (月) 13:10:48 - ふりすくん
あなたに研究者としてのプライドがあるなら、ご自身で考え、行動したほうが良いように思います。

細胞内シグナル経路系の実験手法について質問です。 削除/引用
No.1251-1 - 2009/09/28 (月) 13:03:48 - ppp
あるシグナル経路の実験の計画をしております。
過去の実験からタンパクAで細胞を刺激すると細胞内でタンパクB→タンパクCというシグナルが伝わります。
私は『タンパクB→タンパクC』の経路がタンパクDによって仲介されているかどうかをこれから調べようとしています。
この場合、タンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を用いてタンパクCの発現を確認するといった感じなのでしょうか。
また、その場合は『細胞にタンパクBの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクDの阻害剤のみ入れる場合』、『細胞にタンパクBの阻害剤とタンパクDの阻害剤を入れる場合』の条件でタンパクCの発現を確認するのでしょうか。
そしてこの実験はどのような実験手法が良いでしょうか(例えばWBやPCRなど)
すごい初歩的な質問で恐縮ですが、どなたか教えてください!!

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