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CAG repeatsのシークエンス解析について トピック削除
No.1250-TOPIC - 2009/09/27 (日) 17:10:09 - ryoko1985
このたび，遺伝子診断をまかされるようになり，
非常に困る事態に直面しましたのでご相談いたします．
点変異等のシークエンス解析は普通に問題なく，解析できるのですが，
CAG repeats病(SCA3)のサンプルでシークエンス解析をすると，
リピートの最後の部分が上手く読めずに正確なリピート数がわからない
状態で非常に困っております．
forward primer，reverse primerでそれぞれ行ったのですが，
何れもその最後のところで正確に読めない状態です．
皆様，何かアドバイスをして頂けないでしょうか？
宜しくお願いします．
　
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No.1250-7 - 2009/09/28 (月) 18:44:37 - ami
ami様と言っても私は偽物でございますが（笑）

(無題) 削除/引用
No.1250-6 - 2009/09/28 (月) 18:28:42 - Pumpkin
あ、そうですね。R様のご意見で、ami様のご意見の読み違えに気付きました。潔く謝罪します。direct seqなのですね、すみません。

浅はかにもクローニング前提で考えておりました。私が扱ったことがある遺伝子は3反復配列+1逆反復配列で、最初の反復がヒトによって数が異なるというものでしたが、クローニングないしはPCR増幅産物の長さで見ていたので、そういう誤解をしてしまいました。

(無題) 削除/引用
No.1250-5 - 2009/09/28 (月) 16:33:18 - R
繰り返し配列がヘテロなサンプルでは、direct sequenceでは繰り返しの最後の部分はもう一方のアレルと混在するので機械的には読めないです。
(長さで分離していくため)

その場合、波形を目で見て読んでいくとたいてい分かると思います。

もしくは、一旦PCR産物をplasmid vectorにcloningして10 clones程度をsequenceすると機械的にもきれいに読めると思います。
(繰り返しの場合、PCR errorが起きやすいので、私はdirect sequenceにしますが)

Sequenceは自分の目で波形を見るのが大切だと思っています。

ご参考までに。

(無題) 削除/引用
No.1250-4 - 2009/09/28 (月) 16:18:40 - ~
リピート数を調べることが目的なのですよね。

探す対象としては、
1.同じCAGリピートでシークンシングしている文献
2.GC richの配列を読んでいる文献、キット
3.他の方法でCAGリピート数を調べている文献
があると思います。

PCR産物の長さでリピート数を調べている文献を見かけましたが、
貴方の場合にはシークエンシングは必須なのでしょうか？
http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/65/18/8514
http://www.pnas.org/content/94/7/3320.full

必要であれば、1, 2の文献を探して、試してみるしかないと思います。
(やっているラボに教わりにいければ、よりいいですが)

(無題) 削除/引用
No.1250-3 - 2009/09/28 (月) 15:57:44 - Pumpkin

>片方のアレルが正常であれば、そのようなぐにゃぐにゃになってもいいように

トピ主さんの質問は上記のようなものでなく、CAGの繰り返し配列をきちんとシークエンスしたいというテクニカルのみの質問ですよね？

繰り返し配列やGCポリマーなんかはPCRも掛かりにくく、シークエンスも読めないという状況がしばしばありますが、それ相応に工夫してきているので色々と検索してみるのがいいと思います。実際にはどのようなリピート（単にCAGが続くだけですか？それがかなり続くのですか？）か知りませんが、転写シークエンス法だとかいろいろ方法はあるように思います。PCRがかかれば、増幅産物の長さでもいけそうですが、単にCAGの3文字が増えていくだけでは、「正確な」数が分からないということでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1250-2 - 2009/09/28 (月) 14:19:23 - ami
診断ということはサンプルは人ですよね。

そのCAGは両アレルともなのでしょうか？

片方のアレルが正常であれば、そのようなぐにゃぐにゃになってもいいように思うのですが。

考え方違いますかね？

おおさんお願いします。


失礼します。

CAG repeatsのシークエンス解析について 削除/引用
No.1250-1 - 2009/09/27 (日) 17:10:09 - ryoko1985
このたび，遺伝子診断をまかされるようになり，
非常に困る事態に直面しましたのでご相談いたします．
点変異等のシークエンス解析は普通に問題なく，解析できるのですが，
CAG repeats病(SCA3)のサンプルでシークエンス解析をすると，
リピートの最後の部分が上手く読めずに正確なリピート数がわからない
状態で非常に困っております．
forward primer，reverse primerでそれぞれ行ったのですが，
何れもその最後のところで正確に読めない状態です．
皆様，何かアドバイスをして頂けないでしょうか？
宜しくお願いします．
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