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(無題) 削除/引用 No.1249-8 - 2009/09/30 (水) 20:08:30 - こうじ TOPO使っています。 High-fidelityの酵素を使ってもdA付けて シークエンスを確認する癖がついているもので（恐怖症？） 私の場合、ほとんどのケースが 使うベクターサイズ自体が大きく 入れる遺伝子が大きくても1kbpいかない程度までなので ここでかける時間と手間でセーブポイントにしています。 ただ、TOPOの調子が悪くクレーム出したこともありますし（Lotが原因のようです） ある遺伝子のクローニングのときに 末端数十bpがTOPOに入れると必ず削られる事態があってから 二度と使わないと言っている同僚もいます。

(無題) 削除/引用 No.1249-7 - 2009/09/30 (水) 18:46:15 - A >その後、このTopo vectorからinsertを切り出し、目的のベクターに >入れています。 以前PCR産物を直接制限酵素処理してライゲーションを行いどつぼに はまったことがあります。最終的には制限酵素がうまくいっているか どうかの確証が持てなかったのでTopo vectorではありませんが一旦 T-vectorにクローニングして断片を切り出して目的のベクターへ入れ ました。T-vectorへのクローニングするのメリットはin situさんが おっしゃっているように切り出す前にPCRが期待していた通りに行わ れたかどうか全配列を確認できることと制限酵素処理が本当にうまく 行われているかどうか目で確認できることですから、それ以来私は 多少時間がかかってもT-vectorに一旦入れる方法を使っています。 Topo vectorですが以前いたらラボで使いましたが確かによく入り ましたから個人的にはお金が許すのであれば使いたいところです。 私が素朴な疑問さんの立場ならTopo vectorにクローニングして 配列を確認した後に断片を切り出し、クローニングします。

TOPO利用法 削除/引用 No.1249-6 - 2009/09/27 (日) 19:43:27 - in situ 通常のクローニングだったら、TOPOに入れてからということはせず、直接目的のベクターに入れます。 ただ、PCRミュータジェネシスを行う時に、一周回せない（GCリッチとかで）ベクターの場合、一度TOPOに入れてから一周回してから、切り出し・目的のベクターにサブクローニングという手順を使うことがあります。 あとは、多数のフラグメントのシーケンスを読みたいときにTOPOに入れてTOPOベクターに対するプライマーでシーケンスすれば両末端の配列も読めます。 スレ主さんのような状況でしたら、直接制限酵素処理してライゲーションします。

(無題) 削除/引用 No.1249-5 - 2009/09/27 (日) 16:07:26 - 素朴な疑問 おおさん >TOPOクローニングシステムは比較的新しいシステムで (といっても10年くらいたちますかねぇ、、、、、) それ以前からこの手の仕事している者にとっては、あまり メリットを感じません。 非常に力強いコメントありがとうございます。 そういうものなのかあと感じれただけでも質問した甲斐がありました。 ありがとうございました。 >みさん >primer作成時に制限酵素サイトの前に任意の3塩基を付加しています。 なるほどそういった工夫が必要なのですね。 とても勉強になしりました。 みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1249-4 - 2009/09/27 (日) 15:50:42 - おお >[Re:1] 素朴な疑問さんは書きました : > > PCR産物という小さな断片は制限酵素に処理処理しにくいなどありますでしょうか？ > PCR産物はベクターを切りよりは、切れにくいと良く言われます。末端の長さなどを考慮に入れると、酵素の選択しも狭まるのではないかとおもえます。 ただ100%切れる必要がないという考えもある程度成り立ちますので、 簡単に比較できるものでもないというのも事実です。

(無題) 削除/引用 No.1249-3 - 2009/09/27 (日) 15:43:31 - み >[Re:1] 素朴な疑問さんは書きました : > > みなさまはどちらの方法を（あるいはこれ以外のalterativeがあるかもしれないですｇが）クローニング時に利用しますでしょうか？ directに入れたいベクターにいれる。 > PCR産物という小さな断片は制限酵素に処理処理しにくいなどありますでしょうか？ ないでしょう。でもprimer作成時に制限酵素サイトの前に任意の3塩基を付加しています。　XXX-制限酵素-specific sequence

(無題) 削除/引用 No.1249-2 - 2009/09/27 (日) 15:42:32 - おお TOPOクローニングシステムは比較的新しいシステムで (といっても10年くらいたちますかねぇ、、、、、) それ以前からこの手の仕事している者にとっては、あまり メリットを感じません。 特殊に加工されたベクターを要するため、毎回キットを 買わないといけません。 というわけで、PCRにしろベクターフラグメントにしろ 通常のライゲーションで対応しています。 実験によりけりとは思いますので、ほかのかたの 利用の仕方とかも聞いてみたいですね。

cloning時に、Topo cloningを使用しますか？ 削除/引用 No.1249-1 - 2009/09/27 (日) 14:53:31 - 素朴な疑問 お世話になります。 これまでgene workはそこまで多くはやっていませんが、それでも数回ほど興味ある遺伝子をベクターに組み込んだことがります。 その際にはPCRで興味ある遺伝子を増やして、それをTopo vectorにcloningしていました。 その後、このTopo vectorからinsertを切り出し、目的のベクターに入れています。 しかし、時間等の節約（？）のため、PCR産物を直接制限酵素処理して、それをdirectに目的のベクターに組み込むことも可能と聞きます。 みなさまはどちらの方法を（あるいはこれ以外のalterativeがあるかもしれないですｇが）クローニング時に利用しますでしょうか？ PCR産物という小さな断片は制限酵素に処理処理しにくいなどありますでしょうか？ どうか経験豊富なみなさまからの意見をいただけますと幸いです。

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