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(無題) 削除/引用 No.1230-6 - 2009/09/25 (金) 10:14:45 - 組織 メタノールの場合は、固定後風乾しても、そのままPBSで洗っても、あまり違いはないかもしれませんね。というのも、私もメタノール固定の後は完全に乾燥させてから染色していますが、免疫染色のペルオキシダーゼブロックだと0.3%H2O2加メタノールで処理した後PBSで洗うだけで乾燥させたりしませんので。標本さえ剥がれなければ、メタノール固定の後はPBSで洗ってそのまま染色しても問題ないかもしれません。むしろPBSに浸けるのであれば、その後の乾燥はあまり必要ないように思います。 私はできるだけ剥離を防ぎたいので、有機系固定液を使うときはしっかり風乾させてから、染色するようにしています。ただいずれにしても、染色成績にはあまり影響しないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1230-5 - 2009/09/25 (金) 09:35:24 - CJ 私はいつもホルマリン固定なのでアルコール固定についてはちょっと知識がいい加減かもしれないので、組織さんの方が正しいアドバイスをできるかもしれません。 なお、ホルマリン固定の場合、固定後ＰＢＳで洗いますが、その後のスライドの染色は乾燥・非乾燥の何れでもうまく行きます。

ありがとうございます 削除/引用 No.1230-4 - 2009/09/24 (木) 22:31:12 - 免疫初心者 ＣＪさん、組織さん、ご返事ありがとうございます。 ＣＪさんに質問ですが、メタノール固定後、乾燥させる場合は、ＰＢＳで洗ってとあるのですが、細胞をＨＥとかで染色するとき、メタノールで固定して、乾燥させてから、ＨＥ染色をしていたのですが、乾く前に染色を始めたほうが宜しいのでしょうか？ 本題とは、少しそれますが、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1230-3 - 2009/09/24 (木) 16:40:41 - 組織 染色中に切片を乾かしてはいけないというのは、個人的には神話の一種だと思っています。CJさんも言われているように、抗体反応や抗原賦活処理をしている時に切片が乾くと、非特異的染色が起こるというのが、本来の注意点だと思います。それ以外のステップでは、プロトコールによって切片を風乾させる場合もあります。 >1.細胞をスライドグラスに張り付けた後は、乾燥させるべきか?否か? 細胞の剥離を防ぐためには、標本をしっかり乾燥させた方がいいでしょう。私もたまにスタンプ標本をとることがありますが、固定前に扇風機やドライヤーの冷風を当てて、標本を乾燥させています。 >2.メタノール固定後は、細胞を乾燥させるべきか?否か? 細胞や未固定凍結切片を有機溶媒で固定した後は、軽く液を切って、そのまま扇風機で30分くらい風乾させてます。メタノールは必要ないかもしれませんが、アセトンなんかは固定後すぐに水溶液に入れると標本が剥がれる可能性があります。 あと組織の特殊染色で、使っている色素がエタノールで色落ちしやすい場合は、エタノール脱水をせずに、風乾で水分を抜いて、キシレン→封入とやることがあります。風乾させても形態は結構保たれています。

(無題) 削除/引用 No.1230-2 - 2009/09/24 (木) 13:19:46 - CJ ・抗体の入った溶液が乾燥すると非特異的吸着を起こします。 ・細胞なり何なりをきれいにスライドグラスに接着させるためには乾燥させねばなりません。 ・固定をすると固定した状態で形態が保持されます。従って固定液が付着した状態で物が乾燥すると、形態がゆがんでしまうかもしれませんね。乾燥させたければＰＢＳで洗ってからするべきでしょう。ただ、プロトコル的には乾燥の必要はないように思えます。

固定方法での乾燥をどうするか? 削除/引用 No.1230-1 - 2009/09/22 (火) 04:07:12 - 免疫染色初心者 細胞の固定方法での乾燥についての質問です。 培養細胞、または血液細胞の免疫染色(CD45、サイトケラチン)を考えています。 1.血液から分離した細胞、または培養細胞をサイトスピンでスライドグラスに張り付けます。 2.15分乾燥 3.-20度、メタノールで5分固定 4.乾燥 5.PBSで洗って、ブッロキングし、以下、抗体を加えていきます。 ここでの質問ですが、免疫染色の過程でサンプルを乾燥させると、バックグラウンドが高くなると一般的に言われていると思いますが、実際はどこからの過程でしょうか? 私は、5以降の過程だと思っていました。Santa Cruzのプロトコールですと、メタノール固定後に乾燥とあるのですが、セルシグナリングのプロトコールでは、2-4%ホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗ってから、メタノール透過処理をしていますが、絶対に細胞を乾かさないように書いています。 細胞を1%ホルマリンで固定した時は、絶対に乾かしてはいけないのは、別の物にも書いていましたが、セルシグナリングの方法では、ホルムアルデヒドで固定してあるから、メタノール固定後でも乾かしてはダメだということでしょうか? 一般に、メタノール固定後は乾燥させるべきなのでしょうか? また、血液の細胞は塗抹標本作成の仕方をみると、スライドに細胞を塗抹後、十分に乾燥とあるのですが、これをしないと後の染色で剥がれてしまうとありました。 細胞をスライドグラスに張り付けたあとは、上のように乾燥させた方が良いのですよね? しかし、臨床で細胞診の検体を取る時は、乾燥させるサンプルとすぐにアルコール固定をするものにわけますよね。後者の分では、絶対に乾かすなと強くいわれました。 そうすると、スライドグラスに張り付けた後は、乾燥させずに、すぐに固定液にいれることになりますよね。 どちらの方法が良いか、混乱しています。 まとめると、 1.細胞をスライドグラスに張り付けた後は、乾燥させるべきか?否か? 2.メタノール固定後は、細胞を乾燥させるべきか?否か? お忙しいところ、申し訳ありませんが、ご教授の程、宜しくお願い申し上げます。

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