全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

通りすがりさん、有難うございます。 削除/引用 No.1228-9 - 2009/09/22 (火) 22:13:58 - 大学生 ＞＞個人的には、ネットで広く他人の意見を聞いてみることが、別に間違っているとは思いません（批判されている方の意見はそういうことではないのかな？）。 そう言っていただけて、少し安心しました。 私の場合、他の方に頼りすぎた部分があったのだと思います。 もっと、根気強く粘っていきたいと思います。 通りすがりさんのおっしゃるとおり、ポジコンもきちんと増幅されませんでした。サイズをしらべ、プライマーダイマーかどうか検討してみます。 バイサルファイト処理での増幅に関する経験からのお話も、もとても参考になりました。 初心者である私に、分かりやすく、丁寧に教えていただけたこと、本当にありがたいことだと思います。 暖かいお言葉とお応え、とても嬉しかったです。本当に有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1228-8 - 2009/09/21 (月) 21:48:13 - 通りすがり 個人的には、ネットで広く他人の意見を聞いてみることが、別に間違っているとは思いません（批判されている方の意見はそういうことではないのかな？）。 お話の感じでは、恐らくポジコンでもちゃんと増幅されていないのではないかと思います（サイズからprimer dimerっぽいとか見当はつかないのでしょうか？）。 蛇足かもしれませんが、 バイサルファイト処理したDNAをテンプレートにした場合、非常に増幅しにくくなります。自分の乏しい経験では、nested PCRでないと増えないのが普通で、運が良いと1回のPCRでバンドが確認できると言った感じでした。そういったことも関係しているのかもしれませんね。

皆様、本当に有難うございます。 削除/引用 No.1228-7 - 2009/09/21 (月) 21:06:09 - 大学生 私のような者がかいたトピックに誠実にコメントを下さって有難うございます。 確かに、こういった場で、他の方のお力を借りようとした私は「間違っている」と思いました。 メチラーさん、早く気付くことさん、ご指摘有難うございました。 皆さんの貴重な場を荒らしてしまって申し訳ありません。 また、それでもお応えくださったamiさん、通りすがりさん、APさん。 本当に有難うございます。 でも、お二人のおっしゃるとおりだと思います。 皆さんのアドバイスを参考に、もう一度自分でやろうと思います。 自分勝手で本当に申し訳ありません。 amiさん＞ 有難うございます。非メチル化コントロールで行えるか検討します。 水がバックグラウンドとして出てきている可能性もあるのですね。 ポジコンの方もネガティブと同様にバンドが出ていましたので、水を使ったことに問題があったのかもしれません。 貴重なアドバイス、親切なお応えを本当に有難うございました。 通りすがりさん＞ おっしゃる通りです。 PCR産物はできないはずなのですが・・・ちなみにサイズが本来作られるはずのものより、小さかったです。 PCRに使う試薬を一つずつ新しいものに変えて試したのですが、結果は変わりませんでした。 もう一度、コンタミを確認してみようと思います。 尻切れトンボで申し訳ありません。真摯なお応え、本当に有難うございました。 APさん＞ primer dimerを見ているだけなのかもしれません。 場数は殆ど踏んでいないです。授業で行った程度だったので・・・。 そこにまず問題があるのかもしれません。授業のときは成功したので、自身を過信していたのだとおもいます。 それと同時にプライマーの設計に問題がないかも調べてみます。 誠実なご指摘と回答、本当に有難うございました。 中途半端で終わらせてしまって申し訳ありません。 お返事を下さった皆様に心から感謝を申しあげます。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　大学生

(無題) 削除/引用 No.1228-6 - 2009/09/21 (月) 10:18:21 - 早く気付くこと ここに質問して問題を解決しようということが 下策であるということに気づくこと。 ここで初心者が実際にいる教官や先輩にディスカッションを食い下がってでもやるということをしないで、ここで質問するということが間違っている。

(無題) 削除/引用 No.1228-5 - 2009/09/20 (日) 22:32:09 - AP コンタミでなければ、primer dimerを見ているだけとか（その意味で、プライマーの設計がよくないのかもという指摘は当たっているかもです）。普通のPCRでもありがちな事なんですけれど、どの程度場数を踏んでいるのかが気にかかります。例えば、バイサルファイト処理なしで普通にPCRをかけたときに正しい産物ができるというようなことは見ているのでしょうか。 >貴方の質問の仕方が「おかしい」「間違っている」と思います。 どこがどうおかしいのか、論証もせず個人の感想的なこと感覚的なことをいうのは論理性の欠如に他ならず、Sciensistとしての適性が疑われます。いちいち説明するのが面倒だというのなら、なにも言わなければいいのに。建設的でない、なにを言いたいのかわからない発言なら、たった一行書くのだって時間の無駄でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1228-4 - 2009/09/20 (日) 18:05:43 - 通りすがり 滅菌水をネガコンとして使った、すなわちテンプレートを入れていない反応で増幅産物ができてしまうということですよね。（ちなみに産物のサイズはどれくらい？） 素直に考えれば、やはりコンタミ以外に考えられないように思いますが、 大学生さんのコンタミでなさそうという根拠はどんなものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1228-3 - 2009/09/20 (日) 12:34:46 - ami メチラーさん厳しすぎます。相手は大学生です。 もう少し親身になって考えるべきではないでしょうか。 >ちなみにネガティブには非メチル化コントロールではなく、滅菌蒸留水を使っています。（参考にした文献ではこちらを使ってました） no goodです。 ネガコンは実験に一番大事です。 非メチル化コントロールは取れないのでしょうか？ 水ではacceptableではないですね。 あるいは、水がバックグラウンドとして出てきてしまっているか。 つまりポジコンではどうなのでしょうか？という意味で聞いています。 ポジコンはうまくバンドはビシャーーーーーンと出ているのでしょうか？ 失礼します。

(無題) 削除/引用 No.1228-2 - 2009/09/20 (日) 11:54:06 - メチラー 貴方の質問の仕方が「おかしい」「間違っている」と思います。

DNAメチル化検出でネガティブにバンドが出てしまいます。 削除/引用 No.1228-1 - 2009/09/20 (日) 10:54:53 - 大学生 はじめまして、私は医療関係の大学に通っているものです。 大腸癌におけるDNAのメチル化に興味をもって、実験をはじめたのですが上手くいかずに困っています。 環境的に設備などが整っていないので、「バイサルファイト処理後MSP法にてバンド検出（３％アガロース電気泳動）」という方法を行っています。 ところが電気泳動において、ネガティブであるはずのレーンにまでバンドが出てきてしまいました。 ちなみにネガティブには非メチル化コントロールではなく、滅菌蒸留水を使っています。（参考にした文献ではこちらを使ってました） プライマーの設計も参考にした文献の配列をそのまま使っています。 PCRの温度設定も同様です。ただし、その内容量は別の文献における「一般的」というものを参考に多少変えました。 プライマーの濃度は15と20μmol/ℓの二つで行いました。 最初はコンタミかと思ってたのですが、色々試した結果そうではないようです。 大学の先生にも相談したのですが、プライマーの設計に問題があるのかもしれない、と言われました。 まだまだ知識も勉強も不足の状態で取り組んでいるので、勘違いや根本的なミスである可能性も多分にあります。 「おかしい」「間違っている」と思われるところがありましたら、ぜひ教えていただけないでしょうか？ 大変失礼かと思いますが、宜しくお願い致します。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---