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(無題) 削除/引用 No.1224-46 - 2009/09/28 (月) 11:11:02 - もんきち うちの後輩はこれでした　様 　コメントありがとうございます。 > 見たいバンドが数百bpなんですね？100bp以上であれば、アクリルアミドゲルまで使わずとも、TAEではなくTBEでアガロースを溶かし、泳動もTBE中で行えば、解像度の高いキレイな図が得られる可能性が高いと思いますよ。 > 　はい。目的のバンドは200、500bpのバンドです。当方では基本的に大きなバンドをみることが少ないので、主にTBE bufferを用いております。アガロースでもこれくらいのサイズならきれいに見えるはずですよね？ありがとうございます。安心致しました。 > しかし、師匠さんの図は同じマテリアルを使っていても格段にキレイなのですね？もっとよく師匠さんを観察することですね。周りに良い腕を持った人がいるというのは大変恵まれた状況ですね。 　はい。そうなんです。師匠に迷惑にならない程度に食い下がってみようと思います。 > > ゲルの厚さについてコメントして下さった方々、ありがとうございました。私の現在のゲル作成方法は、10cm x8cm程度のガラス板をエタノールでキレイに拭いた後、溶かしたゲルをなんの囲いも無い状態で注いで、表面張力だけでガラス板上に保持するというものです。気持ち悪いくらいキレイな映像が出来ますが、ゲルの厚み以外にも色々と影響する要素があるのでしょうね。 　ゲル板をエタノールで拭いてらっしゃるのですか。早速真似をさせていただきたいと思います。 　上記のゲル作成法はかなり衝撃的でした。憶測するにそれはかなり薄いゲルしか作れないですよね？厚いゲルが正義とかたくなに信じていた私ですが、これからは少しゲルを薄く作るよう心がけてみようと思います。 　この度はご指導ありがとうございました。教えていただいた内容を参考にして、きれいな写真をとれるよう努力して参ります。

(無題) 削除/引用 No.1224-45 - 2009/09/28 (月) 11:04:30 - もんきち 通りすがり様 コメントありがとうございます。 > 普通は1%以下を常用で、それ以上濃いゲルはPCR産物などの小さい物で且つ、サイズが知りたいときや、同じくらいのサイズで何とか分離したい時にだけ特別に作ると思います。 > 常用が1%以上だなんて濃いなと。 　 　常用が１％はこれまでの研究室で慣例的に行われていたので、濃いという感覚がありませんでした。ゲルも安いものではないので、節約の対象に出来そうですね。ありがとうございます。 > > 冷やすのは基本的に低温室です。 > 電源が濡れないように、泳動槽ごと氷に埋める方法もあります。 > 低温室で100Vだと温まるスピードの方が速いので、氷に埋めたり、いっその事バッファーを交換した方が効果があると思います。 > ただ、低温室に持っていくだけの手間なんで、よくやります。 　当方の研究室ではバッファーの交換をあまりしないで流し続ける傾向がみられますので、暖かいときこそ交換することにします。氷に埋めるのも先輩方の了承が得られたら試してみたいと思います。 > > あまり小さい物を流すなら、アガロースよりアクリルアミドの方がいいと思います。 > あとは、アガロースでも透明度の高い物を使うとか、高濃度でも分離能がいいものを使うとか。 　今回の目的産物は200bpと500bpなのでアガロースゲルで頑張ってみようと思います。 　この度はご指導ありがとうございました。とても勉強になりました。

TBE 削除/引用 No.1224-44 - 2009/09/27 (日) 01:32:09 - うちの後輩はこれでした 見たいバンドが数百bpなんですね？100bp以上であれば、アクリルアミドゲルまで使わずとも、TAEではなくTBEでアガロースを溶かし、泳動もTBE中で行えば、解像度の高いキレイな図が得られる可能性が高いと思いますよ。 しかし、師匠さんの図は同じマテリアルを使っていても格段にキレイなのですね？もっとよく師匠さんを観察することですね。周りに良い腕を持った人がいるというのは大変恵まれた状況ですね。 ゲルの厚さについてコメントして下さった方々、ありがとうございました。私の現在のゲル作成方法は、10cm x8cm程度のガラス板をエタノールでキレイに拭いた後、溶かしたゲルをなんの囲いも無い状態で注いで、表面張力だけでガラス板上に保持するというものです。気持ち悪いくらいキレイな映像が出来ますが、ゲルの厚み以外にも色々と影響する要素があるのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1224-43 - 2009/09/26 (土) 23:14:46 - 通りすがり ばいやさんが答えてくれた通りです。 普通は1%以下を常用で、それ以上濃いゲルはPCR産物などの小さい物で且つ、サイズが知りたいときや、同じくらいのサイズで何とか分離したい時にだけ特別に作ると思います。 常用が1%以上だなんて濃いなと。 冷やすのは基本的に低温室です。 電源が濡れないように、泳動槽ごと氷に埋める方法もあります。 低温室で100Vだと温まるスピードの方が速いので、氷に埋めたり、いっその事バッファーを交換した方が効果があると思います。 ただ、低温室に持っていくだけの手間なんで、よくやります。 大掛かりな冷却装置はお金がかかるんで、ヒートパイプを使った簡単な冷却装置で、既存の泳動槽でも使えるものを出せば、結構売れると思うんですけどね。 あまり小さい物を流すなら、アガロースよりアクリルアミドの方がいいと思います。 あとは、アガロースでも透明度の高い物を使うとか、高濃度でも分離能がいいものを使うとか。

(無題) 削除/引用 No.1224-42 - 2009/09/26 (土) 21:35:18 - もんきち >ばいや様 コメントありがとうございます。 >[Re:40] ばいやさんは書きました : > 通りすがりさんではないけど > > > 　当研究室でも本気の時は50%で泳動しているようです。私は新入生なので、そのことを恥ずかしながら知らなかったのですが。。。低温とのことですが、どのように泳動槽を冷やしてらっしゃるのでしょうか？また、バッファーを混ぜると泳動に影響ありますか？昔のラボで、前のヒトが泳動した直後はバッファーが熱くなっているから辞めた方が良いと教わったのを思い出しました。 > > > たぶん普通は泳動槽ごと低温室ですると思います。昔は室温でもできるような冷却装置付きのものがあったように思いますが、今もあるかもしれません。 > 泳動すると熱を持つのでゲルが緩んでくる（DNAが網目を移動しているイメージですが、その網目が広がって移動が早くなったり、いろいろなことが起こるので冷やしたりします。 　低温室で泳動ですか。熱でゲルが緩んで泳動度に影響を及ぼしてしまうのですね。勉強になりました。低温室は当方にはありませんので、泳動バッファーが暖まっていたときは、泳動バッファーを交換して対応したいと思います。 > > バッファーを混ぜるのは循環させることです。泳動していると陰極と陽極でバッファーの組成が変わってくるので。そういう装置も昔に見たっきりです。今でもあると思います。 > 　撹拌の理由が良くわかりました。なんとなく混ぜた方が良さそうだなという漠然としたイメージだったので、とてもためになりました。 > > > > 　申し訳ありません。「濃いので毎回流している」の意味が分からないので、教えていただけますでしょうか？ > > > 濃いのはゲル濃度です。プラスミドなんかを泳動するのが多いと思いますが、2-5kbpくらいだとゲル濃度が0.7-1%くらいだと思います。それ以上はもっと短いものを流すときに特別に作ったりするのが一般的と自分では思っています。 　数百bpの泳動時には２％を使っているので、おっしゃっている内容と概ね合致するものと思います。「結構濃いので〜」の「ので」は「〜を使って」の「ので」ですね！理由の「なので」の「ので」かと勘違いして意味が分からなかったのですが、今ようやく判りました。どうもありがとうございます。 > > ゲル濃度はDNAサイズにもっとも適した分離をするものを作ります。やったことがないけど、SDS-PAGEでDNA（オリゴくらい？）を流す方法もあったと思います。 > > なお、数百bpだときれいに流すのはもうちょっと別のテクニックがあるかと思いますので。（低温、低電圧、ゲル濃度でずいぶんと良くなると思うのですが） 　SDS−PAGEでは、泳動槽を氷に埋めて泳動するとバンドがきれいになるというおまじないのようなものと当方では伝承されていたのですが、DNAの電気泳動でも大事とは思っておりませんでした。ばいや様をはじめ、皆様のご指導のもとゲル濃度を高くし、低電圧にしたことでかなりの改善が見られました。どうもありがとうございました。今ひとつ師匠と肩を並べるまではいかないのでうすが、先日在庫切れだったアガロースも到着しましたので、ゲルを新鮮な状態で流すなどいろいろ試みてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1224-40 - 2009/09/26 (土) 10:30:01 - ばいや 通りすがりさんではないけど > 　当研究室でも本気の時は50%で泳動しているようです。私は新入生なので、そのことを恥ずかしながら知らなかったのですが。。。低温とのことですが、どのように泳動槽を冷やしてらっしゃるのでしょうか？また、バッファーを混ぜると泳動に影響ありますか？昔のラボで、前のヒトが泳動した直後はバッファーが熱くなっているから辞めた方が良いと教わったのを思い出しました。 たぶん普通は泳動槽ごと低温室ですると思います。昔は室温でもできるような冷却装置付きのものがあったように思いますが、今もあるかもしれません。 泳動すると熱を持つのでゲルが緩んでくる（DNAが網目を移動しているイメージですが、その網目が広がって移動が早くなったり、いろいろなことが起こるので冷やしたりします。 バッファーを混ぜるのは循環させることです。泳動していると陰極と陽極でバッファーの組成が変わってくるので。そういう装置も昔に見たっきりです。今でもあると思います。 > 　申し訳ありません。「濃いので毎回流している」の意味が分からないので、教えていただけますでしょうか？ 濃いのはゲル濃度です。プラスミドなんかを泳動するのが多いと思いますが、2-5kbpくらいだとゲル濃度が0.7-1%くらいだと思います。それ以上はもっと短いものを流すときに特別に作ったりするのが一般的と自分では思っています。 ゲル濃度はDNAサイズにもっとも適した分離をするものを作ります。やったことがないけど、SDS-PAGEでDNA（オリゴくらい？）を流す方法もあったと思います。 なお、数百bpだときれいに流すのはもうちょっと別のテクニックがあるかと思いますので。（低温、低電圧、ゲル濃度でずいぶんと良くなると思うのですが）

(無題) 削除/引用 No.1224-39 - 2009/09/26 (土) 00:48:51 - もんきち 通りすがり様 　コメントありがとうございます。 　 >[Re:37] 通りすがりさんは書きました : > 一度薄く作りすぎて、泳道中にゲルの中央部からサンプルが染み出した事があるのと、普通の厚さであれば実用上問題ないのでこだわらなくなりました。 　昔一度、へなちょこなゲル（途中から薄くなるゲル）で泳動してみたところ、同じことが起こりました。 > 電圧も100Vで実用上問題ないと思います。 > (とはいっても、本気で流すときは50Vの低温で、途中でバッファーを混ぜたりもするんですけどｗ） 　当研究室でも本気の時は50%で泳動しているようです。私は新入生なので、そのことを恥ずかしながら知らなかったのですが。。。低温とのことですが、どのように泳動槽を冷やしてらっしゃるのでしょうか？また、バッファーを混ぜると泳動に影響ありますか？昔のラボで、前のヒトが泳動した直後はバッファーが熱くなっているから辞めた方が良いと教わったのを思い出しました。 > そんなに綺麗に分離したいなら、でかいゲルとか使いますしね。 > あんまり綺麗なバンドだと、かえって気持ち悪いですよ。 > 　師匠の泳動パターンは気持ち悪いほどきれいで（まるでカタログやパンフレットのようです）憧れるのと、今のターゲットが数百bpなので、きれいに泳動しないと判りにくいのです。 > それにしても、1〜2%って、結構濃いので毎回流しているんですね。 　申し訳ありません。「濃いので毎回流している」の意味が分からないので、教えていただけますでしょうか？ 　以上宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1224-38 - 2009/09/26 (土) 00:41:41 - もんきち mom-a様 コメントありがとうございます。 お返事が遅くなり申し訳ありませんでした。 > 失礼しました。「低濃度」ではわからないですね。 > その時は0.5〜0.8%くらいを使いました。おそらく、1%以上の濃度のゲルでしたら、特に冷蔵庫で冷やさなくても大丈夫だと思います。メーカーや製品によって同じ濃度でもゲル強度が異なるので、100%保証できるわけではないです が。 　当研究室では通常１あるいは２％のゲルのみを使用しておりますので、必ずしも冷蔵庫に入れて冷やす必要はなさそうですね。安心致しました。ただ、低濃度のゲルは冷蔵庫で固める方がよいとのこと。勉強になります。 > 　 　泳動バッファーの件ですが、私もこれまでゲルがきちんと浸っていれば良いだろうと思っておりました。他の方が大事だと教えて下さったので、今後はしっかりとバッファーを満たして泳動することに致します。 　どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1224-37 - 2009/09/25 (金) 15:39:10 - 通りすがり 1%以上なら冷蔵庫は要らないですね。 自分はばいやさんが言っている様に、ウェルの部分だけ高くなったりするのが嫌なので、余裕を持った普通の厚さです。 一度薄く作りすぎて、泳道中にゲルの中央部からサンプルが染み出した事があるのと、普通の厚さであれば実用上問題ないのでこだわらなくなりました。 電圧も100Vで実用上問題ないと思います。 (とはいっても、本気で流すときは50Vの低温で、途中でバッファーを混ぜたりもするんですけどｗ） そんなに綺麗に分離したいなら、でかいゲルとか使いますしね。 あんまり綺麗なバンドだと、かえって気持ち悪いですよ。 バッファーはmom-aさんと同じく、「ゲルが（泳動終了まで）完全にバッファーに浸っているように」ですね。 それにしても、1〜2%って、結構濃いので毎回流しているんですね。

(無題) 削除/引用 No.1224-36 - 2009/09/25 (金) 11:27:33 - mom-a >低濃度ゲルとはどれくらいの濃度だったのでしょうか？通常我々は1〜2 %のゲルを用いております。 失礼しました。「低濃度」ではわからないですね。 その時は0.5〜0.8%くらいを使いました。おそらく、1%以上の濃度のゲルでしたら、特に冷蔵庫で冷やさなくても大丈夫だと思います。メーカーや製品によって同じ濃度でもゲル強度が異なるので、100%保証できるわけではないですが。 >電圧は私が100V、師匠は50Vでした。 確かに、低電圧でゆっくり泳動した方が泳動像はきれいだと思います。 >ゲルの厚さとバッファーの量 私は、ゲルが（泳動終了まで）完全にバッファーに浸っているように…しか考えていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1224-35 - 2009/09/25 (金) 09:22:02 - ばいや ウェルの部分がbufferから出ているのは気になります。コームの間にあるヘタみたいなゲルが出ているだけならいいのですが。 buffer量はそれほど気にしたことがないです。ちゃんと浸っていれば。そんなに多くのbufferはいらないです。ときどき入れすぎてしまうこともありますが、それでも問題はないです。 で、ウェルの部分がbufferから出ているというとことですが、ウェルの部分だけ（作製時に）表面張力で高くなりすぎていませんか？分離部分ていうか泳動される部分がやたらと薄くなっているとか。その厚さよりサンプルを入れたときの量が多くてDNAが高い位置まで存在するとスメアになります。真横にDNAが移動しますが、移動した先にゲルがないとDNAがゲルから出てしまいます。出て行ってbufferに拡散されるといいけど、完全に抜けないうちはゲルに一部が引っかかったまま（イメージ）移動するのでゲル内を移動するよりも早く移動します。よってブロードになります。だから上部だけ先に移動している形になります。 確認方法は縦にスライスして、寝かして確認すると良いです。 解決方法はサンプル量を減らすか、ゲルを厚くするか。 ちなみに撮影時のピンボケが原因ということはないですよね。一応念のため。

(無題) 削除/引用 No.1224-34 - 2009/09/25 (金) 00:55:05 - もんきち >[Re:30] こうじさんは書きました : > コームを引き抜いたあと、ゲル横からサンプルウェルの状態を確認して > 師匠との違いがありますか。 > 　こうじ様 コメントありがとうございます。 　師匠のゲルのコームを引き抜いた後のウェルをしっかりと観察をしたことはありません。自分のゲルはこのトピックを立ち上げさせていただいてからじっくりと観察してみたのですが、それはあくまでも上からの視点のみでした。次回師匠がゲルを作った際にはしっかりと横からも含めて観察させてもらうようにお願いしてみます。

(無題) 削除/引用 No.1224-33 - 2009/09/25 (金) 00:51:35 - もんきち kou様 コメントありがとうございます。 > 電気泳動後にゲルを横から見たときに、バンドが垂直にならずに斜めに泳動されていませんか？ > 上面側が先に進んで下面側が遅れて（あるいはその逆）泳動されていたりすると、真上から写真撮影したときにスメアをひいているように見えます。 　なるほど！この場合、確かに上から見たらスメって見えるかもしれないですね。しかし、エチブロで染めたバンドを横からとはどのように見るのでしょう？UVを当てながら見るのは難しいので、ローディングダイの青をみれば宜しいのでしょうか？　なにはともあれ、次回泳動をした際にしっかりと観察してみたいと思います。 > > もしそうなら、原因はゲルの厚さと泳動バッファの量が合っていないことなどが原因だと思います。 > > スメア具合を写真で見れるといいのですが... 　ゲルの厚さとバッファーの量とは、ゲルが浸っていれば良いというものではないのですか？当方の研究室では多少ゲルが水面から顔を出していても（ウェルの部分などが）泳動には差し支えないと考えているのですが、どの程度のバランスが最適なのでしょうか？ 　この掲示板では画像をアップすることは出来ないのですね。コンピューターにあまり詳しくないので、データをご覧になっていただく術が思いつきません。申し訳ありませんです。

(無題) 削除/引用 No.1224-32 - 2009/09/25 (金) 00:43:58 - もんきち mom-a様 コメントありがとうございます。 > > 電圧がどのくらい違うのかわかりませんが、これでかなり解決できるかもしれない、という気がしますが。バンドの太さが違うのは、アプライ量そのものが違う可能性もあるのかもしれませんね。 　電圧は私が100V、師匠は50Vでした。アプライ量は若干私の方が多く、師匠は２〜3 ulで、私は5〜6 ulでした。確かにアプライ量によっても差が出そうなのですが、先日2.5ulアプライした時改善はみられたものの、完全にきれいなバンドとはなりませんでした。 > > 低濃度のゲルだと、常温で放置では固まり方が甘いことがあり（室温・時間によりますが）コームを抜いたときにウェルが歪んだことがあります。その場合の泳動像はスメアなんてもんじゃなく汚かったです（涙） 　ここでおっしゃっている低濃度ゲルとはどれくらいの濃度だったのでしょうか？通常我々は1〜2 %のゲルを用いております。参考までに教えていただけますでしょうか。 >

(無題) 削除/引用 No.1224-31 - 2009/09/25 (金) 00:37:01 - もんきち >[Re:27] orzさんは書きました : > ゲルが熱すぎるままトレイにそそいでいませんかね？ > うちは3〜5分くらい冷ましてそそぎますが > 温度差ができてスメります。 orz様 コメントありがとうございます。 ゲルの温度ですが、あまり熱すぎるとゲル板がたわんでしまうので、素手で三角フラスコを長時間触っていても平気でいられるようになるまで冷ましてから注いでいます。 おっしゃっているのは温度が外側の方が冷めやすくて、その結果ゲルの濃度に勾配が生じてしまうということで宜しいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1224-30 - 2009/09/24 (木) 18:45:40 - こうじ ＞もんきちさま コームを引き抜いたあと、ゲル横からサンプルウェルの状態を確認して 師匠との違いがありますか。 ＞うちの後輩はこれでしたさま 薄いことで分解能あげることはたまにします。 薄くきちんとゲル作製、電圧をおさえて（といっても50Vですが）、あと染め の３つでずいぶん変わってはじめは感激しました

バンドが斜めになっていたりしませんか？ 削除/引用 No.1224-29 - 2009/09/24 (木) 18:08:17 - kou 電気泳動後にゲルを横から見たときに、バンドが垂直にならずに斜めに泳動されていませんか？ 上面側が先に進んで下面側が遅れて（あるいはその逆）泳動されていたりすると、真上から写真撮影したときにスメアをひいているように見えます。 もしそうなら、原因はゲルの厚さと泳動バッファの量が合っていないことなどが原因だと思います。 スメア具合を写真で見れるといいのですが...

(無題) 削除/引用 No.1224-28 - 2009/09/24 (木) 14:56:30 - mom-a >電圧は師匠は自分よりも低い電圧で長時間流しているそうなので、今度それを真似てみようと思っています。 >スメアについてですが、スマイリングを若干していて、さらに一本一本のバンドがブロードになってしまうようになってしまいます。これに対して師匠が泳動したものは一本一本のバンドが垂直で、細いバンドとなっていました。 電圧がどのくらい違うのかわかりませんが、これでかなり解決できるかもしれない、という気がしますが。バンドの太さが違うのは、アプライ量そのものが違う可能性もあるのかもしれませんね。 低濃度のゲルだと、常温で放置では固まり方が甘いことがあり（室温・時間によりますが）コームを抜いたときにウェルが歪んだことがあります。その場合の泳動像はスメアなんてもんじゃなく汚かったです（涙） 昔の大きいサイズのゲルを使っていた頃はゲルを泳動槽にセットしてからコームを抜いていたのを思い出しました。今は、ゲル板自体がそういう構造になっていないので、確かにバッファーを注いでから抜けばいいのかもしれませんが、特に不都合がないのでそのまま抜いています。

もしかして 削除/引用 No.1224-27 - 2009/09/24 (木) 14:21:25 - orz ゲルが熱すぎるままトレイにそそいでいませんかね？ うちは3〜5分くらい冷ましてそそぎますが 温度差ができてスメります。

(無題) 削除/引用 No.1224-26 - 2009/09/24 (木) 12:22:04 - もんきち 通りすがり様 コメントありがとうございます。 色々な節約術があるのですね。勉強になりました！ > うちの研究室はフラスコなどで溶かして、使う分だけトレーに注いで、残った物はフラスコに入れたままにします。 > 使うときは再度レンジにかけて溶かすを繰り返すので、複数回レンジにかけたものや、フラスコのまま長期間放置された物はかなり水が飛んでいます。 > おまけに、使っていないレーンのゲルは、カッターで切り取られてフラスコに戻すという、馬鹿みたいな節約も行っています。 　蒸発の意味がわからず、かなり焦ったのですが、これで謎が解けました。ご丁寧な解説をありがとうございます。 > うちの後輩はこれでした様の「バッファーに浸しながら」は「ゲルに充分な量のバッファーをかける」と同じだと思いますよ。 > ゲル全体が水没するくらいバッファーをかけて、浸した状態ということです。 > こういうゲルを濡らした状態でコームを引き抜く操作って、コツとかじゃなくて、基本操作じゃないんですかね？ > 濡らした状態でコームを抜くのが普通で、アガロースなんかは滅多にウェルが崩れないから、時間と手間を節約するコツとして省くと言うだけだと思っているんですが… 　すいません。基本操作なのですね。今までは確実に冷めてからコームを抜くようにしていただけで、バッファーをかけてより慎重に。。という考え方は有りませんでした。お恥ずかしい限りです。今後は大事なサンプルを流すゲルはバッファーをかけてからコームを抜くようにしたいと思います。 　ご指導ありがとうございました。

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