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(無題) 削除/引用 No.1223-7 - 2009/09/23 (水) 15:22:03 - もんきち >[Re:6] あかねさんは書きました : > 以下のサイト役に立つと思います。 > > http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=23 > http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHguide.html あかね様 コメントありがとうございます。 早速教えていただいたサイトを勉強させていただきます。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1223-6 - 2009/09/23 (水) 00:14:07 - あかね 以下のサイト役に立つと思います。 http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=23 http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHguide.html

(無題) 削除/引用 No.1223-5 - 2009/09/22 (火) 23:50:36 - もんきち >[Re:4] あかねさんは書きました : > DNA-FISHの場合は、ターゲットのゲノムDNAとプローブの両方を変成する必要がありますが、 > 大きく分けてターゲットとプローブを別々に変成する方法と、同時に変成する方法の2種類があります。今回記した方法はターゲットとプローブを同時に変成し、そのままHybriさせる方法です。 あかね様 お世話になっております。ご指導ありがとうございます。 同時に変性させていたのですね。失礼致しました。するとプローブは冒頭の4ulのハイブリバッファーに入っていると考えて宜しいでしょうか？ > コクヨのペーパーボンドを使用していました。 他の配列に対するFISHをする際にコクヨのペーパーボンド早速購入を検討したいと思います。あるいは乾燥が問題と考えられた場合に試したいと思います。 > > リピートの配列だと室温で2時間程度Hybriすれば十分なシグナルを得ることができるので、 > ラバーセメントは使かわなくても、問題ないと思います。 ２時間のハイブリで十分なのですか。それはとても有用な情報です。どうもありがとうございます。 もしよろしければ、冒頭の4ulの中にプローブが入っているという質問の続きなのですが、その4ulのプローブ溶液はどのように調製されていらっしゃいますか？リピート配列に対するプローブ溶液調製の計画を練っているのですが、経験不足で困っております。 当方のプロトコールには、 ラベル済みプローブを100ngをエタノール沈殿させ、100％のフォルムアミド8 ulで溶解し、80℃ヒートブロックで10分変性させた後にアイスブロックで急速冷却する。続いて、２×ハイブリバッファーを8 ul加えプローブ溶液とする。 とあるのですが、リピート配列に対するプローブも上述の様な濃度で調製して宜しいものでしょうか？ リピート配列とユニークな配列に対するFISHは相違点があるようなので、もしご存知であればご教授願えますでしょうか。 以上よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1223-4 - 2009/09/22 (火) 22:28:57 - あかね DNA-FISHの場合は、ターゲットのゲノムDNAとプローブの両方を変成する必要がありますが、 大きく分けてターゲットとプローブを別々に変成する方法と、同時に変成する方法の2種類があります。今回記した方法はターゲットとプローブを同時に変成し、そのままHybriさせる方法です。 コクヨのペーパーボンドを使用していました。 http://www.askul.co.jp/p/113087/ ペイパーボンドは乾燥してくると透明になります。15分ほど乾燥させたあとは乾燥してきて透明になっていると思います。Hybriさせるときに湿度を高くしたタッパーに入れると、その水分をボンドが含んでHybri後（O/N)にはボンドの部分が白くなっています。この白くなったポンドはピンセット等で簡単に剥がすことができます。 リピートの配列だと室温で2時間程度Hybriすれば十分なシグナルを得ることができるので、 ラバーセメントは使かわなくても、問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1223-3 - 2009/09/22 (火) 21:52:32 - もんきち >[Re:2] あかねさんは書きました : > DNA-FISHの場合を書きます。 > 4ul のhybri bufferをスライドグラスにアプライし、その上からカバーグラスをかけます。 > 次に、hybri bufferの蒸発を防ぐためにラバーセメントでカバーグラスの周りを封入し、15分ほど室温で乾燥させます。 > 次に、80℃にしたHeatPlateやHeatBlockの平らな部分にプレパラートを起き、10分まちます。 > その後に, 水分を含ませたテッィシュなどと一緒にタッパーにスライドグラスを入れ、37℃あたりでhybriさせます。 > > Good luck あかね様 ご指導ありがとうございます。 教えてくださった内容は、プローブの変性法でしょうか？それともサンプルの変性法でしょうか？ サンプルの変性法と解釈させていただいた場合、HeatPlateでの変性法、ぜひとも参考にさせていただきます。 ラバーセメントとは以下のリンクの商品でよろしいのでしょうか？ http://sankoudo3510.ocnk.net/product/48 パンクの修理にも使えるとあるのですが、それほど強力な吸着力ですと、カバーガラスを剥がす際（ハイブリ後の抗体をかけるために）にカバーガラスが剥がせないのではないかと思いまして。手元にあるプロトコールでもペーパーボンドという接着剤で、カバーガラスを囲い、バッファーの蒸発を防ぐとあったのですが、これらの接着剤は固まった後は容易に剥がせるものなのでしょうか？ 質問ばかりで申し訳ありませんが、どうぞご指導よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1223-2 - 2009/09/22 (火) 20:55:33 - あかね DNA-FISHの場合を書きます。 4ul のhybri bufferをスライドグラスにアプライし、その上からカバーグラスをかけます。 次に、hybri bufferの蒸発を防ぐためにラバーセメントでカバーグラスの周りを封入し、15分ほど室温で乾燥させます。 次に、80℃にしたHeatPlateやHeatBlockの平らな部分にプレパラートを起き、10分まちます。 その後に, 水分を含ませたテッィシュなどと一緒にタッパーにスライドグラスを入れ、37℃あたりでhybriさせます。 Good luck

FISHのプローブの変性方法について 削除/引用 No.1223-1 - 2009/09/18 (金) 23:32:35 - モイモイ いつも勉強させていただいております。 FISHの初心者モイモイと申します。 表記の件で質問なのですが、 プローブの変性の方法とボリュームはみなさんどのようにしてらっしゃいますか？ 手元のプロトコール集を参考にいたしますと、「反復配列のプローブの至適濃度は1〜5 ng/μlで、このプローブ溶液を3〜5ulほど標本にのせ、上からカバーガラスをかける」、とあったのですが、この場合サンプルが１枚のスライドしかない実験系の場合、プローブを変性させるのに、3〜5＋α μlのボリュームで行うことになるかと思います。 変性条件が80℃で10分間とあったのですが、こんなに小さな容積でこれだけの温度をかけると変性が終わった頃には蒸発しきってしまっているのではないかと心配になりました。 プローブが貴重なため、なるべくロスを出さない系で実験をしたいと考えています。 加熱方法とその際のボリュームなど、 どなたかお詳しい方ご指導下さいますようよろしくお願いします。

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