全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

解決済みのトピにすいません。 削除/引用 No.1218-18 - 2009/10/10 (土) 11:56:56 - かわさき in situ様。既に解決済みのトピにいつまでもお付き合いいただきすいません。 ＞変異率も少なく、テンプレートによらずよく走るので結構気に入っています。 なるほど。Primestarは変異率は低いもののExtaqにくらべPCR成功率が低い印象だったので、Phusion良いかもしれません。いちど試してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1218-17 - 2009/10/09 (金) 17:16:13 - in situ 亀レスで申し訳ありません。 理論と実感だとちょっとずれているようですね。 ExTaqの変異率がメーカー表示よりもう少し低かったりするのかもしれませんし、変異が生じる確率が上記のように独立でないのかもしれません。 ちなみに、自分が使っている酵素は最初の方に書いたようにFinzymeのPhusionです。 変異率も少なく、テンプレートによらずよく走るので結構気に入っています。

エラーレートの正確な計算法ありがとうございました。 削除/引用 No.1218-16 - 2009/09/29 (火) 06:36:39 - かわさき 解決済みのトピにすいません。 in situ様、エラーレートの正確な計算法ありがとうございました。 ＞x=8.7x10^(-6)のときは0.647263442 計算上は確かにそうなんでしょうが、私の経験的にはこれよりもかなり高いです。だいたい500塩基に１回程度の割合でしょうか？in situ様のお示しになった確率だとだいたい2000塩基に１回くらいですよね。いつも平均確率が1/500のポアソン分布で2000回試行して1回もあたらない確率（約1/64くらいでしょうか）という感じでスクリーニングスケールを決定していましたが、結構膨大な数になるので、2000塩基ではあきらめていました。primestarが出て、使ってみると確かにエラーレートが減少していたので2000塩基でもクローニング可能となりました。in situ様の経験ではこんなもんという感じのようなので何かが違うのでしょうかねえ。ちなみにin situ様の使用されている酵素はなんですか？

(無題) 削除/引用 No.1218-15 - 2009/09/23 (水) 15:55:09 - in situ TAKARAのホームページを見てみたところ、Phusionなどとは異なるerror rateの算出の仕方をしていることが分かりました。 知識が足りなかったことをお詫びします。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004616 増幅回数が書いていないので、直接比較することはできないのですが、TAKARAのPrime Starは1.3 x10^(-6)のerror rateをもつPfuよりも、TAKARA定義のerror rateで2倍程度の正確さをもっているようです。 これを先ほどの計算式にあてはめて（500bpで20回増幅として）みると、TAKARA Prime Starのerror rateはPhusionやPfuの定義でいうと、1.0x10^(-6)程度と推定できます。

(無題) 削除/引用 No.1218-14 - 2009/09/23 (水) 15:28:13 - in situ すでに済みになっているトピックにレスする形になって申し訳ありません。 かわさき様へのお返事ということでコメントさせていただきます。 >確かに単純に考えるとそのerror rateの増幅サイクル倍なので1 x 10^-6位になりますね。でも実際には増幅の条件によってメーカー表示のエラーレートよりは多めに出るような印象があります。実際8.7 x 10-6とメーカーがいうExTaqでも1000塩基から500塩基に１回のエラーが出るため2000bp以上のものでPCRによる変異がないものを取ることは難しいです。もしPCR後にクローニングされたことがあるのであれば実際の変異率を教えてもらえますか？ 自分は、 ベクターを鋳型にPCR⇒制限酵素処理⇒新しいベクターにクローニング⇒シーケンシング といった流れをよくやりますが、トランスフォーメーションしたあと、コロニーPCRをやって4〜8クローン拾ってシーケンシングをやると今までのところ確実に当たりが拾えています。 最大で2500bp程度のものをやりましたが、問題なくクローニングできています。 運がいい時（？）は全部あたりだったりします。 （たいていそういう時は運を使い果たして他でへまをしますｗ） error rateをxとして 2000bpの鋳型を増幅した際に、最終産物のフラグメント（25回増幅されたものと仮定）のうちある一つに変異が一つも入らない確率はおおよそ ((1-x)^2000)^25 実際には25回丸々増幅されていないやつとかもいるので、もう少し高くなると思います。 出てきた値を代入してみますと、 x=8.7x10^(-6)のときは0.647263442 x=4.4x10^(-7)のときは0.97824023 また、フィデリティが低い酵素を考えてみると x=1.0x10^(-5)のときは0.606529143 x=5.0x10^(-5)のときは0.082079868 x=1.0x10^(-4)のときは0.006736263 となります。 確かに、最後の二つ程度のフィデリティだと10（100）クローン拾っても運が悪いと全部はずれの可能性もあるかも知れません。しかし、ExTaqのerror rateがメーカーの言う通りだとすると、4〜8クローン拾えば解決できるのでは、と思うのですがどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1218-13 - 2009/09/22 (火) 10:04:48 - なんと！ みなさん、沢山のレスありがとうございます。 中年さんのBamHIとBglIIを使ったライゲーションは目から鱗でした。 この方法を使ってみたいと思います。 皆さんご指摘いただいたサイズの問題なのですが、GSTに融合させた場合は問題無く大量に発現させることができています（不溶ですが）。 ただ、pETやBioRadから押し売りされたpPAL7などタグが小さいベクターに載せ替えると発現が全く確認できなくなってしまいます（10種類ほどタンパクを試しましたがどれも同じ現象でした）。 レアコドンの問題等も考えたのですが、Rosettaなどを使用しても解決されず、長さを伸ばせば・・・と考えた次第です。 どうせ不溶画分から精製するので、おおさんご指摘のとおり4つとかつなげても良いのかもしれませんね。 一度サイズを大きくするというのを試すだけ試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1218-12 - 2009/09/20 (日) 08:07:56 - かわさき ＞ここで作製したいのは同じ配列がタンデムにリピートしたものですから、かわさき様の仰る方法だと、２段階目のPCRで用いるプライマーでもリピートの単位が増幅してしまって、つながったものが増えてこないのでは、とあかね様は仰ってるのだと思います。 ああ。そうなんですね。把握できていませんでした。すいません。確かにPCRだとはまりそうです。 ＞ただねえ、普通のPCRでもdirect/inverted repeatがあると難しくなるのに、末端のoverlapよりはるかに長い5'-ORF-3'が完全に相同となる二分子をPCRでつなげるのは、そうそううまくいくのかしら。 そのとおりと思います。すいません。 ＞自分がよく使っているPhusionはerror rateが4.4*10^(-7)とあるので約2,000,000bpに一塩基という率みたいです。 確かに単純に考えるとそのerror rateの増幅サイクル倍なので1 x 10^-6位になりますね。でも実際には増幅の条件によってメーカー表示のエラーレートよりは多めに出るような印象があります。実際8.7 x 10-6とメーカーがいうExTaqでも1000塩基から500塩基に１回のエラーが出るため2000bp以上のものでPCRによる変異がないものを取ることは難しいです。もしPCR後にクローニングされたことがあるのであれば実際の変異率を教えてもらえますか？

(無題) 削除/引用 No.1218-11 - 2009/09/18 (金) 20:25:00 - AP 二対のプライマーセットで次のようなconfigurationでPCRをして、 1. (X)n-(5'-ORF-3')-(5' overlap) 2. (3' overlap)-(5'-ORF-3')-(Y)n 両者を混ぜて(X)nと(Y)n（それぞれ適当な配列）をプライマーにしてPCRをかければ出来そうですがどうでしょうか。(X)nと(Y)nは最初のPCRで使うプライマーのtailとしてつけても良いですし、既に既存のベクターにクローニングされたものを鋳型にできるのだから（pETやpGEX)、insertのflanking vector sequenceでも良いでしょう。 ただねえ、普通のPCRでもdirect/inverted repeatがあると難しくなるのに、末端のoverlapよりはるかに長い5'-ORF-3'が完全に相同となる二分子をPCRでつなげるのは、そうそううまくいくのかしら。

(無題) 削除/引用 No.1218-10 - 2009/09/18 (金) 19:34:42 - 中年 ここで作製したいのは同じ配列がタンデムにリピートしたものですから、かわさき様の仰る方法だと、２段階目のPCRで用いるプライマーでもリピートの単位が増幅してしまって、つながったものが増えてこないのでは、とあかね様は仰ってるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1218-9 - 2009/09/18 (金) 19:07:29 - in situ スレに関係なく、揚げ足とりのようなレスで申し訳ないのですが、 >おおよそ1/2000bpくらいしか変異が入りませんので とありますが、1/2000bpくらいの変異率ってかなり高くないですか？ 自分がよく使っているPhusionはerror rateが4.4*10^(-7)とあるので約2,000,000bpに一塩基という率みたいです。 本論に関してですが、以前、PCR mutagenesisの応用で、200bp程度であれば、両端のプライマーでextensionの時間を長くして一周回すことで配列を連続させることに成功したことがあります。

説明不足でした。 削除/引用 No.1218-8 - 2009/09/18 (金) 18:05:35 - かわさき すいません。説明不足でした。 確かにoverlapping領域がないと結合できませんね。なので片方の断片に強制的にoverlapping領域を導入します。方法はもちろんPCRです。プライマーで片方の断片のつなげる方の端にもう片方の断片の配列を付加します。これでPCRをかけるとoverlapping領域ができますので、それともう片方の断片を混ぜてからextensionして、さらにつなげたあとの産物の両端においたプライマーで増幅します。PCRですからうまく行かないこともあります。なので基本は制限酵素できってライゲーションだと思いますが、どうしても良い制限酵素がなかったり、配列上の問題で切る事が望ましくない場合はこういう方法もありえると記憶のそこにでも置いてもらえれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1218-7 - 2009/09/18 (金) 17:37:12 - あかね 他の方が指摘下さっているように制限酵素の組み合わせで、 コンストラクトを作成することをおすすめします。 かわさき様がアドバイスされているPCRでつなげる方法は、今回に限っては、使えないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1218-6 - 2009/09/18 (金) 16:29:31 - 中年 私も皆さんと同じく、抗原が短いから発現が悪いという可能性は低いのではないかと思います。 そのことはひとまず措くとして、ライゲーションでタンデムな構造を作るためには次のような方法が考えられます。両端に例えばBamHIと BglIIのようにcompatibleなサイトを付加しておいて、ライゲーションの後にBamHIとBglIIで切断してやると、タンデムなライゲーション産物だけが切れ残るので、望む長さのもののみをゲルから切り出すことが出来ます。

(無題) 削除/引用 No.1218-4 - 2009/09/18 (金) 16:22:36 - かわさき PCRでもつなげることができます。２つの配列の間にoverlappingがあれば、まぜてextensionしてから繋がったあとの配列の両端にプライマーをおいてPCRすれば良いです。overlappingがなければ、プライマーの5末端にoverlaping配列を加えて片方の断片に対してPCRしてから行なえば良いです。この方法の利点は制限酵素と違って余分な配列を加えなくて済むという点です。PCRによる新規変異の問題はTAKARAのPrimeStarでPCRすればほぼ解決します。おおよそ1/2000bpくらいしか変異が入りませんので・・・。

(無題) 削除/引用 No.1218-3 - 2009/09/18 (金) 15:55:07 - こうじ 10kDaなら小さすぎるとか無いですよ。 発現量が低いということは、 レアコドンが多いとか目的タンパクに毒性があるとかなど 考えられますがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1218-2 - 2009/09/18 (金) 14:16:35 - おお >タンパクが小さすぎるためかほとんど発現がみられませんでした GSTだけだとどかっと発現するので、どかっと発現してもよさそうですが、、、 何かの理由で発現効率が落ちているようなきがします。 そんな状態でタンデムにつないで解決するかなあって、、、 もしかして、可也が不溶画分にいってないですか? つなぐのはライゲーションでいいでしょうね。 ただ向きを考えると何か工夫が欲しいところです。 BanIとかを利用してBanIサイトを両サイドにもつようなプライマー を作り、PCRして両端に制限酵素認識サイトをつくり、 BanIカット後ライゲーションという方法があります。 ユニダイレクションにライゲーションできます。 たねあかしはしたのURLで。 ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16314267?ordinalpos=5&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum ま、10kDaくらいなら4ー6ぐらいつぐらいつなげても よさそうですが、もともとの発現効率が悪ければ もっと悪くなる可能せいはありますので、、、

DNAをタンデムにつなぐ方法 削除/引用 No.1218-1 - 2009/09/18 (金) 13:19:20 - なんと！ いつも参考にさせていただいています。 現在、抗体作成に取り組んでいます（別スレッドでもお世話になりました）。 といっても、まだ大腸菌で抗原を作成している段階なのですが、抗原の大きさが約10kD、DNAにして300bp程度です。 始めはpETで作成したのですが、タンパクが小さすぎるためかほとんど発現がみられませんでした。 現在はGSTタグをつけて発現させているのですが、もし目的の300bpを前後につなげて600bpにすれば20kDとなり、GSTなどの大きなタグ配列をいれずにpETで発現させることができるのではないかと考えております。抗原配列を繰り返すというような話を以前聞いたことがある気がしますので、おそらくできるのだと思うのですが、300bpの配列をどのようにつなげば良いのかがよくわかりません。 300bpのblunt endのPCR産物を精製後、Ligaseでライゲーションして、PCRで600bpのものを回収するというのが考えついたアイディアなのですが、もっと簡単な方法があるのでしょうか？ ご教授いただけますと幸いです。 お願いします。

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---