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(無題) 削除/引用 No.1217-12 - 2009/09/29 (火) 04:20:37 - SKK 老人さん。ありがとうございます。N末タグで固定有無で検討ですね。よく分かりました。できれば、老人さんの論文で無くても、参考論文等ありますと助かります。

(無題) 削除/引用 No.1217-11 - 2009/09/25 (金) 00:11:42 - 老人 すみません、２型だからｃ末が細胞外ですね。じゃあｎ末にタグを付けて同じ実験で大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.1217-10 - 2009/09/25 (金) 00:10:01 - 老人 もっと簡単に行きますよ。 ・ｃ末にタグを付けた発現コンストラクトをトランスフェクト １．細胞を固定しないでタグに対する抗体で免疫染色 ２．細胞を固定してからタグに対する抗体で免疫染色 １はその後固定し、２次抗体処理。２は上記に続けて普通に２次抗体処理。 ・２型なら上記で２の場合のみ膜の染色像が見えます。１の場合は１次抗体が細胞の内側に入れないのでシグナルでません。 私、この方法で２型だと論文に書いているので紹介したいところですが恥ずかしいのでやめます。

(無題) 削除/引用 No.1217-9 - 2009/09/23 (水) 09:10:37 - SKK おおさん、シュンさん。ありがとうございました。イメージがつかめました。とても参考になりました。透過性処理有無での蛍光染色、糖鎖付加、プロテアーゼ処理、細胞表面ビオチン→プルダウン→マス、選択肢が増えました。試せる事から行っていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1217-8 - 2009/09/22 (火) 08:47:10 - おお >[Re:5] SKKさんは書きました : > 皆さん、ありがとうございます。 > > 膜上にあることは、細胞表面のビオチン化後のウエスタンで既に明らかにしております。 ん、、、これができるのが分かっているのだったら これを使ってなんとかならないかなぁ、、、、 たとえばビオチンラベル後トリプシン処理して ビオチンぷるダウンごのヘプチドをマスで 同定するとか、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1217-7 - 2009/09/22 (火) 08:32:00 - シュン >シュンさんの方法は、�U型膜タンパクならば、グリコシレーションが起こらないということでしょうか。 N結合型糖鎖の付加は、ERの内腔で最初のコア糖鎖の付加がAsn-X-Ser/Thr配列のAsnに起こりますから、もし、�U型膜タンパク質であれば、C末端が細胞外を向いている（分泌経路ではER,Goliの内腔）ので、C末端側にAsn-X-Ser/Thrを入れれば、グリコシレーションが起こり、分子量の増加が見られると思います。また、逆に、N末端側にAsn-X-Ser/Thrを入れても分子量の増加は見られないと考えられます。 N末端、C末端のいずれかの少し膜貫通ドメインから離れた部分にAsn-X-Ser/Thrを入れて、それぞれの分子量をSDS-PAGE、ウエスタンで調べれば、どちらが細胞外を向いているかはわかるという訳です。また、分子量の増加が糖鎖付加によることを調べたければ、PNGaseFで糖鎖を除去して分子量が元に戻ることを確認しておけばOKだと思います。 また、ビオチレーションで細胞外に出ていることを確認されているとのことだったので、もっと簡単にN末端かC末端のいずれかにHAタグを入れて、細胞を透過処理の有無で、HA抗体でそれぞれ染めて調べるのが簡単かもしれません。透過処理無しでHAが染まれば、それは細胞外に出ていることの証明になり、トポロジーもわかります。

(無題) 削除/引用 No.1217-6 - 2009/09/22 (火) 07:25:47 - おお >[Re:5] SKKさんは書きました : > 皆さん、ありがとうございます。 > > 。おおさんの方法は、すいません。良く分かりません。プロテアーゼ処理したあとのウエスタンでバンドシフトを見るということでしょうか。もう少しお教え頂ければ、非常に助かります。 > C末にタグをいれて、細胞表面とかプロテアーゼがアクセスできるような ところにあれば、c末は消化されてしまいますので、バンドが消滅しますよね。 プロテアーゼの選び方によっては短いフラグメントが見れるかもしれません。 あとはC末以外に認識できる抗体があれば、それでバンドシフトも見れますので、 そのサイズなどからプロテアーゼがきいている部分を割り出(マップ)して、 トポロジーを推測するということです。

(無題) 削除/引用 No.1217-5 - 2009/09/22 (火) 05:51:00 - SKK 皆さん、ありがとうございます。 膜上にあることは、細胞表面のビオチン化後のウエスタンで既に明らかにしております。疑問なのは、本当に�U型なのか、I型なのかを調べたいと考えております。amiさんの方法だと、膜にあるかどうかしか示せないと思うのですが・・・。シュンさんの方法は、�U型膜タンパクならば、グリコシレーションが起こらないということでしょうか。おおさんの方法は、すいません。良く分かりません。プロテアーゼ処理したあとのウエスタンでバンドシフトを見るということでしょうか。もう少しお教え頂ければ、非常に助かります。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1217-4 - 2009/09/19 (土) 07:06:30 - おお 証明ですか、、、、 えっと、2型だからC末が細胞外ですよね。 C末末端にタグをいれて、細胞表面をプロテアーゼ処理とか でしょうか、、、FACSと同じ考えですが、、、でも細胞表面に出てなかったらこの手は難しいかもですね。 膜にそって局在していることは確かめられていますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1217-3 - 2009/09/18 (金) 19:53:55 - ami GFP融合にしてその局在を蛍光顕微鏡で目視。 これに限る。

(無題) 削除/引用 No.1217-2 - 2009/09/18 (金) 12:34:07 - シュン N末かC末にグリコしれーションサイト（Asn-x-Ser/Thr)を入れて、ウエスタンで電気泳動のバンドシフトを確認するのはどうでしょうか？ もちろん、分泌経路に乗っているタンパク質であることが必須ですが。

II型膜タンパクの証明 削除/引用 No.1217-1 - 2009/09/18 (金) 12:12:22 - SKK いつも参考にさせて頂いております。 現在、新規の分子を見出したのですが、解析ソフトによると、どうもその分子が�U型膜タンパク質の可能性があるようです。そこで、本当かどうか検討したいのですが、証明の仕方をご存知の方、是非、ご指導をお願いできればと思います。私が考える限りでは、N末とC末それぞれにタグをつけて、FACSにて解析ということが思い浮かびますが、もっとエレガントな方法をご存知であれば、お教え下さい。

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