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(無題) 削除/引用 No.1213-8 - 2009/09/22 (火) 00:16:22 - おお パーフェクトなポジコンかどうかは分かりませんが 例えば生理的に発現が下がるような状態で半減期 が変わるかとか、発現にそれなりに差がある状態で 半減期が変わるかなど、みてみるといいかもしれませんね。 まず文献で示されている薬剤が効かない(多分それを ポジコンにしようと思ったわけでしょうけど)ということ もありますので、その辺の解明も考えないといけない かもしれません。たまに再現性の取れないデーターも パブリッシュされていますので、絶対的でないかもしれませんし トランスレーションでの制御はないとお考えでしょうか? 半減期を算出できれば、そちらの可能せいという事を 考えているとはおもえますが。。。 >私もその薬剤を自身の実験で試してみたのですが、分解促進が確認できず、他に何か、そのタンパクが分解促進を受けるポジコンになる薬剤はないかと悩んでいたところでした。 あなたの薬剤処理で半減期が変わるなら、その報告されている薬剤の ポジコンは薬剤の性質その他を問わないのなら入らないと思います。 厳密なコントロールを置いた実験ではないですが、ちゃんとした 比較実験として公表可能とおもえますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1213-7 - 2009/09/20 (日) 23:21:59 - c まず、この蛋白質がある薬剤の刺激により分解促進を受けるという論文があるということなので、おそらくそこにはどのような分解系が関与しているか論じているのではないかと推察します。その分解系を既知の阻害剤なりRNAiによって抑制すれば、この蛋白質がその分解系の制御下にあるならば、この蛋白質は蓄積して増加してくる事が予想されますので、それをウェスタンで示せばよいのではないかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1213-6 - 2009/09/19 (土) 17:49:00 - Deg 皆様 アドバイス、誠にありがとうございます。 大いに参考になります。 ただ、私の質問の意図が曖昧だったところもあるようです。すみません。 もう一度、整理して書かせてもらいます（あまり変わってないかもしれませんが・・・）。 ある薬剤により、あるタンパク質のタンパク量が減少することをウェスタンで確認しており、また、mRNAレベルでは不変であることをノザンで確認しています。次に、パルス・チェイスで、その薬剤により分解促進を受けているのかどうかを検討したい次第です。 実は、そのタンパクが分解促進を受ける別の薬剤に関する文献があります。私もその薬剤を自身の実験で試してみたのですが、分解促進が確認できず、他に何か、そのタンパクが分解促進を受けるポジコンになる薬剤はないかと悩んでいたところでした。 なので、 ami様、 p53ではないですが、別のタンパクに関してはパルス･チェイスでチェイス時間とともに分解されることをみています。ただ、目的のタンパクの、「薬剤による」分解「促進」がみられていません。あと、CHX処理群を用意する意味合いがわからないのですが、宜しければ御教授いただけませんでしょうか。 c様 分解の経路がユビキチン・プロテアソーム系なのかどうかはわかりません。というか、分解なのかどうかもわかりません（それを示すためにやろうとしているパルス･チェイス実験に関する質問です）。ただ、細胞内のタンパクを非特異的にユビキチン化するような薬剤があれば分解促進されるだろうから、いいポジコンになるのではないかと考えた次第です。 おお様 私の目的とするタンパクがリン酸化により分解の制御をうけているかどうか、調べてみます。実際リン酸化を受けるタンパクなので。もしリン酸化により分解が促進するようなら、その条件はポジコンになりそうですね。非特異的にユビキチン化を起こせるわけではないということだと、尚更です。

(無題) 削除/引用 No.1213-5 - 2009/09/19 (土) 06:42:13 - おお >例えば、非特異的に細胞内のタンパクのユビキチン化を促進してさせる薬剤など、です。 この文面だけ見ればプロテアソームインヒビターでいいと思うのですが それでも質問を上げるということは、それでは納得してないということでしょうか、、、、 ただユビキチン化は非特異な反応ではありませんので、 何でもかんでもというわけには行かないと思いますが、、、 たしかにユビキチンのように細胞内で認識されてタンパクに非特異に クロスリンクするようなケミカルがあればいいかもしれませんが そんなのありますかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.1213-4 - 2009/09/19 (土) 06:36:14 - おお どんな情報をコントロールとして求めるわけでしょうか、、、 それによってちがうとおもいます。 パルスチェイスの実験自体を確認したいのであれば 薬剤なしで、半減きが同じような実験で示されている タンパクを使えば良いわけですし、もしたの実験の 比較で異なった数字がでるのが気になる場合は 半減きの可也長いタンパクと比較的短いタンパク でモニターしてみて、系が働いているかみることが できます。 なにか薬剤を入れるという所でコントロールをとる とするなら、いろいろな可能性があると思いますので 自身の使う薬剤の性質とかの考慮もしないといけない のではと思いますがどうでしょうか、、、、、 なんでも良いと仰るなら、燐酸化で分解が制御されている タンパクがありますので、フォスファターぜインヒビター とか使えるかもしれませんが、あなたが使おうとしている タンパク質ということであれば全く意味がない 可能性があります。 コントロールをちゃんと取れるようになれば、一流の 科学者になれるという話を聞いたことがあります。 一度自身の実験で何を示すために、どんなコントロールが 必要か自問してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1213-3 - 2009/09/17 (木) 21:15:56 - c この辺は素人なので立ち入った事は分かりませんが、細胞の中の蛋白質分解酵素はいっぱいあるし、その薬剤で影響をうけるような蛋白質分解系の基質になっている蛋白質でないとポジティブコントロールにならないのではと思いました。ユビキチンプロテアソーム系なのでしょうか。薬剤名を明らかにしなくてもいいので、せめて先行研究からどのような蛋白質分解酵素への影響が示唆されているかという情報があれば有益なサジェスチョンがもらえるかもかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.1213-2 - 2009/09/17 (木) 21:00:08 - ami p53のdegradationをポジコンで見ればいいでしょう。 それからCHX処理群も忘れないでくださいね。

タンパク分解促進 削除/引用 No.1213-1 - 2009/09/17 (木) 19:13:14 - Deg あるタンパクが、ある薬剤により分解促進を受けているかどうかを パルス・チェイスにより検討したいのですが、 その際にポジコンになるような薬剤をご存知の方がおられたら お教えいただきたく、よろしくお願いします。 例えば、非特異的に細胞内のタンパクのユビキチン化を促進してさせる薬剤など、です。

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