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(無題) 削除/引用 No.121-3 - 2009/03/02 (月) 18:57:49 - ＄ >in situ様 うまくいっていたときのサイクル数は４０ですが立ち上がりは非常に早くハウスキーピング遺伝子が20サイクルくらいで立ち上がっていました。 抽出方法はうまくいくのはＩＳＯＧＥＮを使用しています。しかし、微量サンプル（96穴プレート）を扱うに当たりISOGENでは厳しいので細胞からダイレクトに逆転写反応へ持って行けるＲＮＡ抽出試薬を使用しました。 ランダムプライマーについては私にとって新たな知見です。試してみたいと思っています。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.121-2 - 2009/03/02 (月) 17:24:52 - in situ 一般的に逆転写効率に関しては ランダムプライマー＞Oligo dT＝特異的プライマー といったところではないでしょうか。 特異的プライマーを用いると、対象のRNAのみが逆転写されるので効率が良くなると思われるかもしれませんが、実際プライマー非依存的な非特異的な逆転写が多く起きているようです。 また、randomプライマーだとRNA高次構造による逆転写阻害を回避できるという趣旨の記事が前のフォーラムにありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2040 ですので、おっしゃっているような状況だと、特異的プライマーを使うより、ランダムプライマーを用いた方が感度が上がるかもしれません。 あと、抽出方法を変更しただけで検出レンジから外れてしまうというのが若干気にかかります。 うまくいっていた時のサイクル数はどのくらいなのでしょうか？

リアルタイムＰＣＲ法（特異プライマー利用)について 削除/引用 No.121-1 - 2009/03/02 (月) 14:21:49 - ＄ 現在、細胞からのリアルタイムＰＣＲを行ってある遺伝子の定量を行っております。 olig DTプライマーを用いて逆転写反応をしたあとのtwo step法で行っており良好なデータを得ることができております。 しかし、使用する細胞がそれほど多くなく多検体サンプルを処理するにあたり、ＲＮＡ抽出方法を変更しました。変更したことでＲＮＡ量は少なくなりました。そしてリアルタイムＰＣＲを行ったところ、増幅の立ち上がりが当然ですが遅くなり定量ができなくなってしまいました。 そこで質問なのですが、一般論として逆転写反応を遺伝子特異的プライマーで行うと増幅の立ち上がりは早くなりますか？ もし同じような事象を経験したことが有る方はご意見またはアドバイスや解決方法を示していただけるとうれしく思います。

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