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(無題) 削除/引用 No.12-10 - 2009/03/01 (日) 03:45:10 - A 皆さんにアドバイス頂いた同僚の結果報告です。 高塩濃度、塩基性バッファー、PEGなど複数の条件を検討した結果 抗体カラムから塩基性のGlycine-NaOHバッファーで溶出できたそうです。 皆さんにお礼を言っておいてほしいとのことです（同僚はヨーロピアン）。

(無題) 削除/引用 No.12-9 - 2009/02/13 (金) 21:29:20 - A 名無しさん tag無しで発現させたことはないのですが配列を見ると疎水的なパッチに なりそうな部分があり、加えて以前リフォールディングの条件検討で私が 手伝った印象ではTagよりもタンパク質自体が非常にアグリゲーションを 起こしやすい性質の様です。培養細胞の系はStableでコンスタントな発現 が見られます。ただその量は多量ではないがあきらめるのはちょっとという量です。培養細胞系のこの発現量、そして封入体とはいえ下手に大腸菌で 多量に取れてきてしまったことで同僚は深みにはまっているような感じです。 （名無し）さん 情報ありがとうございます。L-Argの凝集抑制効果についてはリフォールド の条件検討の際に使ったのですが残念ながら殆どリフォールドしてくれ ませんでした。もちろん抗体カラム上のタンパク質は変性状態ではありま せんがL-Argはこのタンパク質の凝集を抑えるのには適していない印象です。

(無題) 削除/引用 No.12-8 - 2009/02/13 (金) 17:17:42 - （名無し） 僕は細胞培養上清から抗体を精製するとき、弱酸性のL-アルギニン溶液(pH4)を使っています。L-Argは凝集抑制効果が高く、また弱酸性で溶出できるので、タンパクへのダメージが少ないです。 詳しくは、Googleで検索して下さい。 key word[凝集抑制　L-アルギニン] お勧めですよ。

(無題) 削除/引用 No.12-7 - 2009/02/13 (金) 00:31:09 - 名無し 大腸菌で封入体になってしまうということならば、動物細胞で発現させても正しくフォールディングできない可能性が大きいとおもう。この場合は、多くは合成されてもフォールディングの失敗を繰り返してるうちにERADとかみたいな機構ですぐ分解されるとおもうし、分解されない場合はラフERとかで凝集して不溶化する可能性もある。見かけ上、発現が低いのもその辺に原因あるかもしれない。細胞内で凝集不溶化してしまう場合は細胞の生存や増殖にも良くない影響がでてくるとおもう。もしトランジエントだとトランスフェクション効率の善し悪しも絡んでくるし、一過的発現だし。いずれにしても大腸菌でうまくいかないリコンビナントを動物細胞でやればもしかしたらーーー、というのはいろいろ問題がありそうで、あまり得策でない気がする。（一定量を確保したいなら特に。）もとに戻ってタグの種類や位置を変えるなどコンストラクトの設計を再検討して大腸菌でやった方が方がむしろ早道のように思う。もしタグがくせ者ならば、抗体で精製するということで、タグ無しのものを発現させれば封入体にならずうまく取れるのでは。

(無題) 削除/引用 No.12-6 - 2009/02/12 (木) 17:44:58 - A 名無しさん レスありがとうございます。 同僚にはアドバイス頂いたように煮沸ではなく50Cぐらいでサンプルを 準備するように伝えておきます。 培養細胞系でのHis-tagタンパク質の発現はあまり経験がないのですが どうやら少なくともNiカラムの前に別のカラムをはさんでNiカラムに 吸着するタンパク質を除くことによってもしかしたら精製できるかも 知れないと思い始めています。まあ先に書きましたようにタグがカバー されてしまっている可能性のほうが高そうですが。

(無題) 削除/引用 No.12-5 - 2009/02/12 (木) 11:25:11 - 名無し 非還元条件では煮沸しない方がいいです。還元剤なしでSDS中で煮沸すると蛋白質によってはペプチド結合の一部に化学的な切断がおこるらしいということを昔聞きました。2%SDS存在下ならば室温かせいぜい５０Cくらいで１０分くらいおけば抗体は変性して抗体と抗原の間の結合は十分外れるはずです。 動物培養細胞からHis-tag 蛋白質をNiカラムで高度に精製するのは難しいです。Hisのクラスターみたいな配列を持った蛋白質は結構あるようで、Niカラムにはいろんな蛋白質が結合し、結果としてBGがとても高くなります。大腸菌や酵母ではあまりこういうことはありません。大腸菌のようにクマシーでバンドが分かるほど大量発現することは難しいので、収量も多くないです。

(無題) 削除/引用 No.12-4 - 2009/02/12 (木) 10:36:05 - A 情報ありがとうございます。 推敲したつもりなのですが文章が一部おかしいですね。 TK-1さん： Triethylamineやhigh saltということですが具体的にTK-1さんが使われた riethylamineやhigh saltの濃度、溶出後の中和など宜しければもう少し 詳しいプロトコールを教えて頂けませんか？同僚は目的蛋白質を培養細胞 のアッセイに使う予定です。教えて頂いた条件で蛋白質が変性しなければ いいのですが。 名無しさん： 抗体は以前大腸菌で発現させ、封入体から精製したHis-tag付きの蛋白質を 抗原として作成されました。同僚はその精製した蛋白質の巻き戻しの条件 検討をしたのですがうまくいかず、現在培養細胞にその蛋白質を発現 させています。当然こちらの蛋白質にもHis-tagをつけたのですがtagが外に 出ていないのかニッケルカラムに付きません。そこで抗体カラムによる 精製を試みているところです。発現量はかなり少なく最初に濃縮を兼ねて イオン交換カラムを使っているのですが他の蛋白質が複数混在しています。 これを除くために抗体カラムを使っています。 WBに関しては確かに非還元で煮沸してゲルにのせれば軽鎖のバンドとの 区別が容易になるはずですね。

(無題) 削除/引用 No.12-3 - 2009/02/11 (水) 22:00:11 - 名無し もしL鎖が問題ならレジンからSDSで溶出するとき、beta-MEなしのSDS sample bufferで室温で溶かしだせば、L鎖の混入はかなり減らせる（０にはできないと思うけど今の１／１０くらいにはなると思う。）。あとは普通に溶出後に溶出された液にbetaMEいれてボイルして電気泳動する。コントロールでサンプル流してないAb-レジンも同じ風に処理して、横のレーンに流す。WBしてシグナルがコントロールより強ければそれは多分、L鎖じゃなくて抗原蛋白質の本物のシグナル。 リコンビナント蛋白質ということですが、抗体で精製ということはHAとかフラグにたいなタグとかですか。それともその蛋白質の抗体ですか。抗体カラムどうしても調子悪ければ、抗体使わなくてもいけるタグとかにするのもいいかも。それかタグと蛋白質の間にTEVとかのプロテアーゼの認識サイトいれて、いったんレジンにくっつけといてからプロテアーゼでそこ切って溶出とかもいけるとおもう。これだと蛋白質が凝集とかしにくいマイルドな感じだし、ついでにタグも除けるしいいかもとか、いま思った。

http:// 削除/引用 No.12-2 - 2009/02/11 (水) 21:31:49 - TK-1 酸でだめならTriethylamineなどのbasic solutionでやってみてもいいのでは。よくやるのはが逆にAntigen columnを使って抗体のaffinity purificationですが、AcidではeluteされなくてBasicで出てくることはよくあります。 それでだめなら、high saltでやってみてください。ただし、やりすぎるとカラムがだめになります。

抗体カラムからの溶出 削除/引用 No.12-1 - 2009/02/11 (水) 17:47:02 - A 過去にも幾つかトピがたったと思うのですがその中には知りたい情報が ないようなので新しく立てさせて頂きました。 私ではなく現在のラボの同僚が現在あるリコンビナントタンパク質を 抗体カラムを使って精製しようとしています。抗体カラムはGEのCNBr セファロースにrabbit-pAbを架橋して作成しました。溶出にはpH2.8の Glycine-HClバッファーを使用しているのですが殆ど溶出されてきません。 カラムにのせた時の抜けには目的タンパク質が殆ど出てきていませんし、 ビーズを1xSBバッファーで煮沸してゲルで確認すると目的タンパク質と 思われるバンドが見られるのでタンパク質がカラムにのっているのはます。WBで確認したいのですがバンドの位置がAbの軽鎖の位置に近いためはっきり しません（残念ながら今ある抗体はpAbのみです）。同僚同士で話し合った ところこのタンパク質は凝集しやすいタンパク質で現在溶出に使っている 低いpHの影響でカラム上沈殿しているのではないかと想像しています。 もし仮に抗体がmAbでエピトープがはっきりしているのであればその ペプチドを準備して溶出バッファーに含めて競合によって溶出というても あるのですがpAbではそうもいきません。 お聞きしたいのは抗体カラムからの溶出でGlycine-HClバッファーの様な 酸を使う以外の方法でタンパク質の溶出をする方法はないでしょうか？ 何方か情報をお持ちでしたら書き込み宜しくお願い致します。

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