BioTechnicalフォーラム [プロテアソームインヒビターのポジティブコントロールについて]

プロテアソームインヒビターのポジティブコントロールについて

No.1181-TOPIC - 2009/09/10 (木) 14:59:25 - N

いつもお世話になっております。
さっそくですが、現在私は、細胞培養時にプロテアソームインヒビターであるMG132を添加して培養し、目的タンパクの分解を抑制する実験を行なっております。
今の所MG132が目的タンパクの分解を抑制しているデータは得られておらず、検討を要する感じなのですが、この際試薬がワークしている事を確認出来るポジティブコントロールには何のタンパクを検出したら良いのか分からず悩んでおります。
なお、目的のタンパク質は文献的にはユビキチン化されてプロテアソームにより分解を受ける事になっています。目的としては、ここにさらに別の遺伝子を導入して、目的タンパクの（プロテアソームによる）分解機構に影響があるのかについて解析したいと考えております。
検出はウェスタンブロッティングで行なっております。
これまで行なった検討は、MG132が50μMで8時間培養という条件と、MG132が10μMで24時間培養という条件で行なっておりますが、いずれもMG132の有無による発現量の差は見えておりません。
また、タンパク発現量のコントロールとしてはbeta-actinを検出していますが、これもMG132の有無に関係なく検出しています。
なお、細胞はNIH3T3に目的タンパクを遺伝子導入したものを使っています。
MG132が効いてくる濃度が目的タンパクと異なっても構わないと思っております。
目的タンパクの分解機構がプロテアソーム以外にもあるのか、単に試薬が効いてないだけなのか分からず困っております。
ご経験のお有りになる方で、何かご存知でしたら何でも結構ですのでよろしくお願い致します。
　

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(無題)

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No.1181-11 - 2009/09/14 (月) 13:26:33 - obama

私はIkB-aをポジコンにしてました。

(無題)

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No.1181-10 - 2009/09/14 (月) 05:31:04 - おお

>[Re:7] みさんは書きました :
> >[Re:5] amiさんは書きました :

> >[Re:2] 臭いご飯食べて腹痛で苦しいさんは書きました :
> > 普通はtotal lysateを抗Ub抗体でIBすればいいと思いますが。
>
> この案は解決に導く可能性がありますね。
>

http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=1098
関連したとピを昔立てたので、参考になるかもと思いました。

ライセイトをユビキチン抗体で染めると、見事レーン全体上半分が
真っ黒になります。ECLplusとかちょっと強めのやると、
1秒のコンタクトでまっくろです。

たしかにサンプルを100倍ぐらいに薄めて乗っければ、インヒビター
の効果も見れるかもしれませんが、、、、、

もう一つ気になるのはUb-Ub同士の結合がK63を介するpolymerizationは
分解シグナルにならないという話です。

ライセートでK63を介するpolymerizationを検出していて、
Ub-Ub同士の結合がK48を介するpolymerization(プロテアソームで分解される)
が増えたとしても、K63を介するpolymerizationがそれの5倍とか
あったばあい20%位の増加です。ウエスタンで検出ってちょっと苦しいいなって
おもうわけです。K48を介するpolymer特異的な抗体なら解決するかもしれません。
たぶんそういう抗体があると思っているのですが、今直接研究に関係がないので
調べていません。

(無題)

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No.1181-9 - 2009/09/13 (日) 19:02:23 - ami

>本物もコメントがpoorなので区別できません、、、

確かに

(無題)

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No.1181-8 - 2009/09/13 (日) 18:49:16 - ami(本物)

本物です。

p53に一票、なのですが、

＞目的タンパクの分解機構がプロテアソーム以外にもあるのか、単に試薬が効いてないだけなのか分からず困っております。

この問いに満足な答えを与えられるかどうか、、inhibitor実験にはいつもついてまわる話ですが、、ちゃんと目的の蛋白を分解するのを阻止する程度に効いている、ってことはなかなか示せないので、、何か他の気の利いた実験が必要にはなると思います。

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＞この人が偽物のamiさんかな？poorなコメントが目立ちますね。

本物もコメントがpoorなので区別できません、、、

(無題)

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No.1181-7 - 2009/09/13 (日) 18:30:39 - み

>[Re:5] amiさんは書きました :
> 試薬がワークしてるだけの確認だけならトータルのタンパクを見ればいいでしょう。
>

トータルでCBB染色でもすれば分かるとでも言いたいのでしょうか？
この人が偽物のamiさんかな？poorなコメントが目立ちますね。

>[Re:2] 臭いご飯食べて腹痛で苦しいさんは書きました :
> 普通はtotal lysateを抗Ub抗体でIBすればいいと思いますが。

この案は解決に導く可能性がありますね。

(無題)

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No.1181-6 - 2009/09/13 (日) 14:38:08 - おお

>[Re:5] amiさんは書きました :
> >この際試薬がワークしている事を確認出来るポジティブコントロールには何のタンパクを検出したら良いのか分からず悩んでおります。
>
> 試薬がワークしてるだけの確認だけならトータルのタンパクを見ればいいでしょう。
>
> あえてp53とかいちいちＩＰするのってどうなんでしょう。

素朴な疑問です。トータルでみれるのでしょうか、、、、
ご経験に基づいたコメントでしたらすいません。

(無題)

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No.1181-5 - 2009/09/13 (日) 14:27:36 - ami

>この際試薬がワークしている事を確認出来るポジティブコントロールには何のタンパクを検出したら良いのか分からず悩んでおります。

試薬がワークしてるだけの確認だけならトータルのタンパクを見ればいいでしょう。

あえてp53とかいちいちＩＰするのってどうなんでしょう。

(無題)

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No.1181-4 - 2009/09/13 (日) 05:52:40 - おお

p53は私もまっ先に思いつきますね。ユビキチンの疾患(癌)への
関与が注目されるようになったきっかけともいえる
実験だったとも思えます。

(無題)

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No.1181-3 - 2009/09/12 (土) 15:04:02 - 名無し

p53（野生型）は分解が速くて良い対照になります。その他各種転写因子も多くは分解速いです。そういうのは調べればいくらでもでてくると思います。ついでに言いますと50 uM, 8 hrや10 uM, 24 hrはやり過ぎです。投稿した時懸念を示されるかも知れません。