ひとつ相談させてください。
VEGFR-1の細胞外ドメインの染色を行っております。以前は免疫蛍光染色を行ったいたのですが、うまく染色できないことから、まずABC法で行ってからということになり、固定は行わずに、ABC法で染色しています。
ご相談申し上げたいのは、VEGFR-1(Flt-1)の一次抗体を入れたものの染色はできたのですが、一次抗体を入れてないものまで染色されてしまうということです。以下に実験方法を記載します。何か心当たりの点がありましたら、些細なことでも結構ですのでご教授いただけたら幸いに存じます。
ちなみに二次抗体,blocking等はVECTRR社のUNIVERSAL Quick Kitを、酵素基質溶液はVECTOR社のAEC Substrate kitを使用しています。
1) PBS wash 1回
2) 2.5% normal horse serum 2滴/well 20分
3) PBS wash 2回
4) 一次抗体 37度incubatorにてover night。
5) PBS wash 5分×3回
6) 0.6%H2O2＋メタノール ( 100μl H2O2, 4900μl メタノール) 20分
7) PBS wash 5分×3回
8) 二次抗体 10分
9) PBS wash 5分×3回
10) Strptavidin/peroxidase complex reagent 5分
11) PBS wash 5分×3回
12) AECにて染色 15分から20分
13) PBS wash 5分×3回
14) ヘマトキシリン原液にて1分間染色
15) 水道水流水にて3分洗浄
16) パラフィンにて封印。
以上です。よろしくお願いします。
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