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(無題) 削除/引用 No.117-14 - 2009/03/03 (火) 23:02:00 - 横レスですが その遺伝子／タンパク質、ホントに発現してますでしょうか。 特定の条件下でないと発現しない遺伝子／タンパク質だったりしませんか？ （例として、サンプルが初期胚だったら胎生〜日目のみ発現など） 染色条件だけでなく、サンプルも論文にあわせていますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.117-11 - 2009/03/03 (火) 22:24:23 - CJ なかなかうまくいかなくて大変なようですね。 IHCは同じ条件でやっているはずなのに違った結果が出たりするので奥が深いものです。著者に問い合わせるのは手ですが、それでもうまくいかないこともありえます。今回の場合は抗体が悪い（癖がある）のではないかとにらんでいますが…。IHCの決め手はよい１次抗体を選ぶことにつきます。 インキュベーション時間と温度は染色強度やきれいさに関係しますが、シグナルが出る・でないには関係しないと思いますよ。私は１次抗体は普通室温オーバーナイトですが、病理のせっかちな人は１次抗体１時間とかでやったりしますし。

(無題) 削除/引用 No.117-10 - 2009/03/03 (火) 20:51:07 - 名無し 直接著者にメールを出して、注意点、コツのようなもの（固定の時間とか、論文に書いてないようなこと）を詳しく聞くのが一番の早道だと思います。（このとき相手が論文のデータを出すのに使用した抗体のロット番号も聞いておきましょう。またできれば自分の方法も伝えた方がいいでしょう。）コレスポンデンスオーサーに出せば、実際にその実験をした人に転送してくれるでしょう。論文として公開されていますから、そうした質問には無条件に誠実に対応する義務がありますし何も遠慮することはありません。条件検討のために、時間や高価な抗体を無駄にしないためにもそうすることを勧めます。組織の免疫染色は、抗体にもよると思いますが、しばしばちょっとした条件の違いでも結構染まり方変わります。またある抗体ではbestの条件でも別の抗体では全然よくないこともときどきあります。やった人しか知り得ないようなことがあっても、そういうことは何故かみなさん論文にちゃんと書いてくれません。

(無題) 削除/引用 No.117-9 - 2009/03/03 (火) 17:49:29 - nara 皆様，お返事ありがとうございます． 賦活化は，一度オートクレーブをやってみましたが（TUFで），結果はだめでした． 固定は4％PFA（市販の調製済みのもの）を使い，ラットの組織ですが24時間ほど固定しています． 賦活化の方法を変えてみるのも検討してみます． あとは，一次抗体の反応時間（や温度）も関係するかもしれないと思いますが，いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.117-8 - 2009/03/03 (火) 00:19:52 - hisage もし凍結組織切片を作れる環境があれば試してみるのも良いかもしれませんね。 固定条件はどうでしょうか。 もしPFA固定ならPFA粉末を溶かすときにNaOHを加えすぎていて、固定液がアルカリ性になっているとか。過剰固定になっているとか。 私は体験したことがありませんが、某社の抗体で論文上は使えるはずの抗体でも使えなかった…という話を聴いたことがあります。 賦活化の方法も色々あるので検討してみると良いかもしれません。 昔ながらの方法から、HistoVT Oneのような調製済みの試薬を使う方法など様々です。ご検討下さい。

組織の処理(特に固定) 削除/引用 No.117-7 - 2009/03/02 (月) 20:02:47 - BR-2 あくまでも私の経験と印象ですが… 同一抗体(同じ濃度など)、同一組織(同じ動物種)であっても、 固定法や固定時間しだいで、染色は結構変わることがあります。 なので、例え同じパラフィン切片であっても(固定が違えば)、 場合によっては賦活なしで染まることもあれば、 賦活してはじめて染まる場合もあります。 もし組織サンプルや抗体、時間に余裕があれば、 試しの切片を一枚賦活してみてはいかがですか？ とは言っても賦活もいろいろあって、さらに 切片はがれの問題も出るかもしれませんが… っていうか、私はこういうことが好きなので、 やってあげたいくらいです…

(無題) 削除/引用 No.117-6 - 2009/03/02 (月) 11:39:39 - AKT48 賦活化の方法によって、シグナルの有無は変わりえると思いますが。 あと組織の固定、下処理も何らかの影響があるように思います。

(無題) 削除/引用 No.117-5 - 2009/03/02 (月) 09:43:28 - nara 皆様，お返事ありがとうございます． 切片はパラフィン包埋切片を使っています． 用いている抗体が悪い可能性も考えましたが，同じ抗体を使って免疫染色をした論文がありますので（これもパラフィン切片，抗体濃度も合わせています），抗体が使えることは確かだと思うのです． 抗原も，タンパクのような種によって異なるものではないので，問題はやはりなんらかの手順にあると考えているのですが・・・ 賦活化しているなら，論文には記載されているはずなのですね． どうしてもダメなら，論文の著者に聞いてみるというのも手かと思いますが･･･

(無題) 削除/引用 No.117-4 - 2009/03/02 (月) 03:43:08 - CJ 少なくとも凍結切片を使った実験の場合、デフォルトは「しない」です。賦活化しているのなら、論文にそう書いてあるはずです。 抗体によっては（というか、多くの抗体は）変性した抗原を認識しませんから、賦活化すると（変な言葉ですが）シグナルがでなくなったりします。 どのような種類の抗原、抗体ですか？

(無題) 削除/引用 No.117-3 - 2009/03/01 (日) 21:38:53 - 通りすがり 抗体が悪い可能性はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.117-2 - 2009/03/01 (日) 19:43:18 - ami 論文の著者に聞いてみましょう。

免疫組織の賦活化 削除/引用 No.117-1 - 2009/03/01 (日) 18:30:34 - nara 免疫組織で，シグナルが出ずに困っています． 賦活化が問題ではないかと思っていますが，過去の論文を何本か見ても，賦活化の方法は書いておらず（ブロッキングや抗原抗体反応のインキュベーション時間については記載がありますが），どの方法で賦活化したらよいのかわかりません． 賦活化の方法（熱処理，酵素処理など）は抗原の種類によるものだと思うのですが，論文に書いていないということは，賦活化は行っていないという可能性が高いのでしょうか？ ご助言よろしくお願いします．

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