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(無題) 削除/引用 No.1161-6 - 2009/09/07 (月) 14:09:12 - End 皆様 Invitrogenから回答が来ましたので、乗せておきます。 ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー いつもお世話になっています。 さて、結論ですが、先生がご心配されているように、インサートがクローニングされていても ccdB遺伝子産物が活性型で発現し、大腸菌が致死になるケースはありえると考えています。 一般的な青白選別で白コロニーにインサートが入っていたり、また薄い青のコロニーなど 中間的なものが出現してしまうのと同様です。 このような選別方法は完璧ではありません。 ちなみに、本社では、150 bp以下のインサートでは問題が起こりえると考えているようです。 ただし、この長さはあくまでも目安になると思います。 目的にもよるかもしれませんが、まずは生えてきたコロニーを確認されて「あたり」が得られれば あまり深追いされることは無いかと思います。ただし、場合によっては、「あたり」が生えてこない こともありえることを認識しておいていただく必要もでてくるかと存じます。 以上、よろしくお願いいたします。 ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー とのことでした。

(無題) 削除/引用 No.1161-5 - 2009/09/07 (月) 12:39:55 - パンタ 目的によるのでは？ 本来このベクターはPCR産物を（一時的に？）クローニングするためのもので、インサートの向きは考慮しなくていい場合がほとんどだと思われます。 完全にフレームがあってもクローニングできるなら、話は別ですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1161-4 - 2009/09/07 (月) 00:30:30 - mcp 自分も疑問に思っていました。 Topoを含む青白判定に用いられるベクターでは、インサートが小さい場合、クローニングできていてもlacZ遺伝子産物に近いものが発現し、青色のコロニーをつくることがあると実験書で読んだ事があります。 つまり、ある程度以上の大きさの配列がクローニングされると、lacZ遺伝子産物がうまく作れず、白色のコロニーができる、ということのようです。 これと同じように、一定以上の大きさの配列がクローニングされることで、lacZ-ccdB合成遺伝子産物がうまく作られず、細胞が生き残るのではないかと自分なりに解釈しています。 もしかしたら程度の内容ですみませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1161-3 - 2009/09/06 (日) 20:37:02 - End 僕もそう思ったんですがccdbはlacZaとの融合遺伝子という形で発言しており、インサート（マルチクローニングサイト）はlacZaの内部なんですよね…

(無題) 削除/引用 No.1161-2 - 2009/09/06 (日) 19:50:35 - ザンギ 質問内容はccdBの不活性化についてのように思いますが、 あまり深く考えたことはないのですが、ccdBのORFからみたらインサート配列 は挿入変異ですから、ccdB活性に対してセンシティブなサイトをクローニング サイトにしてるんだろうと思ってました。

Zero Blunt TOPOの原理 削除/引用 No.1161-1 - 2009/09/06 (日) 17:01:01 - End Invitrogen社のZero Blunt TOPO PCRクローニング キットを使用しています。 http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/K2800-20_001.shtml これまで、セルフライゲーションの場合はccdbが働き致死、インサートが入るとccdbが発現せずに生き残ると理解していました。 しかし、インサートが3の倍数で下流のccdbとフレームが合い、stopコドンも入っていないような断片の場合はccdbまで翻訳が進み、クローニングできないような気がします。 現実的にはクローニングできているので良いのですが、その理由がわかりません。 どなたかTOPOの原理について御教授いただけないでしょうか？ よろしくおねがいします。

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