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(無題) 削除/引用 No.1160-10 - 2009/09/07 (月) 19:40:18 - 通りすがり blottingで見た場合、そのものはシャープなシングルバンドになるのですか？

(無題) 削除/引用 No.1160-9 - 2009/09/07 (月) 16:01:20 - 九州の某タンパク素人さん >>ばいやさん 培養液自体がどろどろであってコンタミって可能性は絶対にありません。 硫安沈殿は遠心して沈殿を回収して使っていま

(無題) 削除/引用 No.1160-8 - 2009/09/07 (月) 10:05:19 - ばいや 素人なのでアドバイスらしいことはできませんが、疑問だったので。 返答してくださっている人たちはみんな破砕後に粘度が高くなったことについて書かれていますが、はじめの質問では培養液がドロドロであるように見受けられます。コンタミではないですよね？ 九州の某タンパク素人さんさんは発現タンパクが原因であるように書かれていますが、みなさんは異なります。ネガコンでもドロドロになるかで破砕の仕方かどうか分かるのではないかと。 自分もDNAが原因かなと初めに思いましたが、ある程度原因を追究するほうが近道ではないかと。 酵母での発現が初めての人と、そうでない場合など情報がある方が解決へのスピードが変わってくると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1160-7 - 2009/09/06 (日) 22:11:03 - c DNAだろうか？と。なぜならそもそも酵母ってソニケーションしたくらいで壊れるかなあ？と思います。酵素処理とか強いデタージェントと組み合わせているのでしょうか。酵母というととにかく丈夫で、強固な細胞壁を壊して中の蛋白質やDNAを取り出すのは、バクテリアや培養細胞と比べてこれはかなり大変という印象があるのですが。またDNAがどろどろになってるということは、単にDNAが混じってるというよりも、クロマチンが変性してしまってDNAがほどけてるという事だと思うのです。精製が目的ということなので、果たして蛋白質にとってそのような過酷な条件で抽出されているのかなあという点も気になりました。何か分泌している成分や細胞壁の成分とか、それと抽出溶液の成分が反応し合ってるとか、あるいはすでに死んで壊れた細胞が多いとか、そういうことはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1160-6 - 2009/09/06 (日) 09:12:45 - おお >[Re:4] DNAさんは書きました : > ソニケーションではDNAがバラバラになってDNAではドロドロしないはずですが。 タンパク抽出用には弱いソニケーターもありますから、 一概にいえないと思いますが、、、、 >[Re:2] DNAさんは書きました : > 蛋白にコンタミしやすく、ドロドロするのは頻繁にDNAなのですが、ODスペクトルは計ってみましたか？ OD値はトータルのライセートでそこまで分かりますでしょうか? RNAもありますし、、、、、 > > 破砕は、酵母でしたら、フレンチプレスですか？ > > 初期段階で濃縮するのは、あまり関心しません。陰イオン交換などでDNAを除去できることは多いです。 細胞壁を酵素で消化してからタンパクを溶出しているようなきがしますね。 酵母はよく分かりませんが、マンマルでは塩濃度を生理的かそれより低い濃度 で弱いデタージェントを使うと染色体が完全に壊れず遠心でペレットに きます。 また、DNAが溶出するような条件では比較的つよいソニケーションや注射ばりをとおしてで断片か することもありますが、溶液として吸い取ったりする扱いはしやすく なりますが、膜を使って濃縮するのは厳しいです。 その他にDNase Iを使うと言うのもマンマルでは選択肢だと思いますし、 グラスビーズを使うとDNAが溶けでそうな条件でもビーズにからまって、 除けることがあります。 初期の精製としては大雑把なフラクショネーションをするために バッチ吸着はいいアイデアと思いますよ。あと、あらい樹脂(比較的 粒子サイズの大きい物をつかいまずは粗精製をするのがいいかと思います。 DNAであればインイオン交換で比較的高い塩濃度でもトラップできるかと思いますのでバッチで目的のタンパクがつかない濃度で除いてしまうこともできると思えますね。 ぎゃくに陽イオン交換であればDNAがつきませんから物を吸着させて DNAを排除できます。 大昔学生の時あるたんぱく質の精製で研究室でやってた方法は、硫安沈殿を 目的のタンパクが沈殿しない条件でおこない、CMセルロースを加えバッチ吸着 (高塩濃度でイオン相互作用ではなく疎水相互作用で吸着したので それを利用したみたいです)。一気に溶出し濃いフラクションをえて、 ゲル濾過で精製といったかんじでした。そのあと必要におうじてDEAEとか の分離のうのたかいクロマトをしてました。 あとDNAだと思うのですが、多糖だったらとか思ったりも、、、、

(無題) 削除/引用 No.1160-5 - 2009/09/06 (日) 04:58:13 - DNA 硫安沈殿でも、DNAは除去できます。たぶん。その後溶かしたとき、遠心などで不溶物は完全に除くようにします。

(無題) 削除/引用 No.1160-4 - 2009/09/06 (日) 04:33:31 - DNA ソニケーションではDNAがバラバラになってDNAではドロドロしないはずですが。 1 M？ NaClとかで、主にDNAだけを吸着させたり、ステップ的に塩濃度を変えて、最初の精製を狙ったりします。

(無題) 削除/引用 No.1160-3 - 2009/09/05 (土) 23:27:53 - 九州の某タンパク素人さん 破砕は機械がソニケーターしかなく、これを利用しています。 ＯＤスペクトルは測定したことがないので、次にでもしてみようと思います。 ただ、陰イオンでＤＮＡを取り除くことができるようですが、それをするならＤＥＡＥでしてみようと思います。このときは、ＤＮＡだけをカラムに吸着させるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1160-2 - 2009/09/05 (土) 22:14:43 - DNA 蛋白にコンタミしやすく、ドロドロするのは頻繁にDNAなのですが、ODスペクトルは計ってみましたか？ 破砕は、酵母でしたら、フレンチプレスですか？ 初期段階で濃縮するのは、あまり関心しません。陰イオン交換などでDNAを除去できることは多いです。

粘性の高いサンプルの精製 削除/引用 No.1160-1 - 2009/09/05 (土) 21:34:17 - 九州の某タンパク素人さん 早速質問させていただきます。タンパクの精製についてなのですが、非常に粘性が高く、この粘性をなくす方法に悩んでいます。 酵母を培養し、菌体を破砕することでタンパクを回収しているのですが、非常に粘性が高く精製に困っています。 違うタンパクについて、同じ発現系・培養液・培養方法で実験している他のラボの人の培養液では、このような粘性が全く見られず、私のタンパクのみがドロドロです。 とりあえず現在の精製は菌体を回収し、サンプルの体積を減らすために硫安沈殿を行っているのですが、その次のステップに悩んでいます。アミコンなどの膜を用いた濃縮は一瞬で膜が詰まってしまいます。オープンカラムについてもすぐに詰まってしまってしまうので、バッチ法しかないのかなという気がします。

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