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(無題) 削除/引用 No.1160-30 - 2009/09/18 (金) 16:22:42 - けんたろうはかっこいいささん > あらかじめbufferで膨潤、平衡化したDEAEセルロース樹脂に > 2.0Mの塩を加えたサンプルを通し、その通過画分を回収した上で > 平衡化したbufferでwashした画分も回収 > それと、2.0Mの塩をサンプルに加えたというのは、 > たいていの蛋白は溶出されるけれどもゲノムDNAは溶出されないから、 > ということなのでしょうか。 質問者さんのお考え通りです。 > bufferには8Mの尿素を含んでいても樹脂は大丈夫なのでしょうか。 これについては行ったことがないのでわかりません。 > 最後に、カラムの洗浄、再生は可能なのでしょうか。 可能でしょうが、私は使い捨てにしています。汚いサンプルを流していますし、ＤＥＡＥ自体も安いものを使用していますので

(無題) 削除/引用 No.1160-29 - 2009/09/18 (金) 00:56:16 - H.K. >[Re:28] けんたろうはかっこいいささんは書きました : > > 私がやっていた方法は2.0Ｍの塩を含んだサンプルをDEAEに通し、フロースルーしたサンプルとさらにその後Washによる溶液を回収しました。塩濃度を高くすることでカラムとのインターラクションが低下し、DEAEに通すことができました。カラムを通した後のサンプルは粘性が低減することにより、他のカラムでも使うことができるようになりました。 > アドバイスありがとうございます。 この方法を使わせていただこうかと考えておりますので、 念のため４点確認しておきたいことがあります。 あらかじめbufferで膨潤、平衡化したDEAEセルロース樹脂に 2.0Mの塩を加えたサンプルを通し、その通過画分を回収した上で 平衡化したbufferでwashした画分も回収、という手順でなされたことと 理解してよろしいでしょうか。 それと、2.0Mの塩をサンプルに加えたというのは、 たいていの蛋白は溶出されるけれどもゲノムDNAは溶出されないから、 ということなのでしょうか。 また、そのbufferには8Mの尿素を含んでいても樹脂は大丈夫なのでしょうか。 最後に、カラムの洗浄、再生は可能なのでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1160-28 - 2009/09/16 (水) 16:01:50 - けんたろうはかっこいいさ >[Re:26] H.K.さんは書きました > 個人的には、WhatmanのCDR(細胞片除去剤)というDEAE-セルロース樹脂をカラムに詰めて使うことを考えているのですが、 DEAE-セルロース樹脂で大丈夫だと思います。 私がやっていた方法は2.0Ｍの塩を含んだサンプルをDEAEに通し、フロースルーしたサンプルとさらにその後Washによる溶液を回収しました。塩濃度を高くすることでカラムとのインターラクションが低下し、DEAEに通すことができました。カラムを通した後のサンプルは粘性が低減することにより、他のカラムでも使うことができるようになりました。

(無題) 削除/引用 No.1160-27 - 2009/09/15 (火) 01:49:14 - c 大腸菌不溶性画分のDNA混入についてですがsonicationでは解決しませんか。あとできるだけ完全にDNA を除去したいならソニケーションあるいはDNase処理である程度DNAを切ってからハイドロキシアパタイトアフ二ティー精製が使えるとおもうのですがどうでしょうか。DNAは蛋白質よりもかなり強く担体に結合すると思うので、フロースルーおよび塩濃度上げて溶出した画分に蛋白質を回収できるし、DNAは担体に残るということで。

(無題) 削除/引用 No.1160-26 - 2009/09/13 (日) 12:28:23 - H.K. ＜済＞のついた後で申し訳ありませんが、ひとつ質問があります。 ＞陰イオン交換を行ってみたところ、粘性を取ることができました。 ですのでやはり原因はＤＮＡだったと思われます。 この陰イオン交換のゲルはどこのどういう製品をお使いでしょうか？ というのは、私自身も、丁度今、 粘性高いサンプルの精製に頭を痛めているところです。 生物種は酵母ではなく大腸菌なのですが、 目的蛋白が不溶性画分にくることが分かっているので、 8M尿素で溶菌させたあと常温で撹拌して遠心した上清を 蛋白溶液として使っています。 粘性の主因となるゲノムDNAですが、 今のところゲル濾過や80%硫安沈殿でも完全には除けていなくて、 アミコンによる濃縮やbuffer交換、イオン交換による精製にも多大な支障がありますので、DNA画分を蛋白から完全分離しておきたいと考えています。 個人的には、WhatmanのCDR(細胞片除去剤)というDEAE-セルロース樹脂をカラムに詰めて使うことを考えているのですが、 もしよろしければそこのところもう少し詳しくお教えいただけませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1160-25 - 2009/09/11 (金) 13:34:24 - 九州の某タンパク素人さん 皆さま、丁寧に質問にお答え頂きありがとうございました。皆さまのご意見んを参考にして色々と実験をしてみました。 >[Re:10] 通りすがりさんは書きました : > blottingで見た場合、そのものはシャープなシングルバンドになるのですか？ blottingで確認したところ、シャープなシングルバンドが見られました。 >[Re:8] ばいやさんは書きました : > 自分もDNAが原因かなと初めに思いましたが、ある程度原因を追究するほうが近道ではないかと。 >[Re:7] cさんは書きました : > DNAだろうか？と。なぜならそもそも酵母ってソニケーションしたくらいで壊れるかなあ？と思います。 確かにソニケーションだけでは完全に破砕することは難しいと思います。ですが、合計10分ほど破砕し、遠心することで上清に目的のタンパクをとってくることはできました。もちろん沈殿にもタンパクは残ってきますが・・・ > >[Re:2] DNAさんは書きました : > 初期の精製としては大雑把なフラクショネーションをするために > バッチ吸着はいいアイデアと思いますよ。あと、あらい樹脂(比較的 > 粒子サイズの大きい物をつかいまずは粗精製をするのがいいかと思います。 > > DNAであればインイオン交換で比較的高い塩濃度でもトラップできるかと思いますのでバッチで目的のタンパクがつかない濃度で除いてしまうこともできると思えますね。 > ぎゃくに陽イオン交換であればDNAがつきませんから物を吸着させて > DNAを排除できます。 陰イオン交換を行ってみたところ、粘性を取ることができました。ですのでやはり原因はＤＮＡだったと思われます。

(無題) 削除/引用 No.1160-24 - 2009/09/11 (金) 11:09:38 - DNA あら、すごいオチ。 個々の質問に的確に、誠実に答えていないのでちょっと、、、。分からなければ分からないでいいのですよ。お礼の言葉もないし。

(無題) 削除/引用 No.1160-23 - 2009/09/11 (金) 10:39:56 - 弘法 それやっぱり酵母じゃなくってコンタミなんじゃないですか？酵母を培養して培地がドロドロって聞いたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.1160-22 - 2009/09/10 (木) 14:11:04 - 九州の某タンパク素人さん 発現したタンパクは菌体内です。

(無題) 削除/引用 No.1160-21 - 2009/09/10 (木) 14:09:46 - ばいや 発現タンパク質の確認は行いましたか？ もうちょっと言えば、菌体内にありましたか、それとも培養液中にありましたか？

(無題) 削除/引用 No.1160-20 - 2009/09/10 (木) 11:58:30 - 九州の某タンパク素人さん > 菌体内発現なのか、菌体外分泌しているのか？ > 培養液が粘性が高いのか、集菌ー菌体破砕後に粘性が高いのか？ > 菌体内での発現です。培養液の粘性が高いのですが、集菌破砕後にも粘性が高いのです。

(無題) 削除/引用 No.1160-19 - 2009/09/10 (木) 01:39:35 - とおりすがる 菌体内発現なのか、菌体外分泌しているのか？ 培養液が粘性が高いのか、集菌ー菌体破砕後に粘性が高いのか？

(無題) 削除/引用 No.1160-18 - 2009/09/09 (水) 23:49:04 - おお 寒天が固まったみたいだったら糖かもしれませんね。 これといった解決方法をしりませんが、アガロースだと 酸性にふると固まらないので、バッファー次第では 何とかなるかも、、、それかガンガンに高速で遠心 するくらいでしょうか、、、超遠心とかで、、、

(無題) 削除/引用 No.1160-17 - 2009/09/09 (水) 22:00:00 - 九州の某タンパク素人さん >[Re:16] cさんは書きました : > DNAならば糸を引くみたいな納豆みたいな感じです。それを繰り返し超音波処理すると、さらさらになって糸引かなくなるみたいな感じになります。なので糸を引かない感じのドロドロ状態ならばDNAではないと思います。ドロドロだというその培養液を少量とって顕微鏡で観察してみることを勧めます。 納豆のように糸を引くような感じではありません。ですのでＤＮＡではないみたいですね。今培養している液について早速顕微鏡で観察してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1160-16 - 2009/09/09 (水) 19:27:41 - c DNAならば糸を引くみたいな納豆みたいな感じです。それを繰り返し超音波処理すると、さらさらになって糸引かなくなるみたいな感じになります。なので糸を引かない感じのドロドロ状態ならばDNAではないと思います。ドロドロだというその培養液を少量とって顕微鏡で観察してみることを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.1160-15 - 2009/09/09 (水) 16:17:54 - 短気者 会話が成り立っていませんよ。

(無題) 削除/引用 No.1160-14 - 2009/09/09 (水) 15:51:59 - 九州の某タンパク素人さん >[Re:13] cさんは書きました : > 細胞を壊す前からすでにドロドロなのですか。それとも、壊す前は（細胞が生きているときは）問題なくて、壊した後のライゼートがドロドロなのですか。前者の場合、培養液を少しとって顕微鏡で見てみた事ありますか。 培養液を見たことはありません。少し思ったことなんですが、培養液のドロドロと破砕後のドロドロは原因が違うような気がしました。遠心で菌を洗う時は、破砕前に破砕に用いるバッファーで洗浄すればよいのでようか？

(無題) 削除/引用 No.1160-13 - 2009/09/09 (水) 03:10:10 - c 細胞を壊す前からすでにドロドロなのですか。それとも、壊す前は（細胞が生きているときは）問題なくて、壊した後のライゼートがドロドロなのですか。前者の場合、培養液を少しとって顕微鏡で見てみた事ありますか。

(無題) 削除/引用 No.1160-12 - 2009/09/08 (火) 17:39:16 - DNA なにか、ぜんぜん状況がつかめません。 外に分泌されるものがドロドロで、細胞を破砕する必要があるのなら、モノは細胞内ですよね。そうしたら、遠心で菌体をよく洗えばいいだけではないのでしょうか？ また、菌体が壊れているのは確かですか？酵素処理してソニックしてるのですか？ もう少し、秘密にしたいところをかくしたままきちんと説明してください。

(無題) 削除/引用 No.1160-11 - 2009/09/08 (火) 14:07:46 - けんけん 私が行っているタンパクでも培養液がドロドロになります。 分泌させているので酵母自体を破砕しているわけではないのですが、ドロドロなのでおそらくＤＮＡ以外のものが原因ではないでしょうか？

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