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(無題) 削除/引用 No.116-10 - 2009/03/02 (月) 12:27:54 - 中年 「済」になった後ですが、そのスタッフがきちんとした実験をされるかただとして、それでもなお仰るようなロット差が出るケースとして次のような可能性が考えられます。 発現プラスミドが大腸菌の生育に悪さをするような場合（ときどきあります）、プラスミドを増やし直す過程で変異の入ったプラスミドを持つ大腸菌が生じ、最終的なプラスミド標品が正しいプラスミドと変異の入ったプラスミドの混合物になってしまうことがあります。変異が入るのは確率的なイベントなので、最後まで入らないかもしれないし（発現量正常）、培養のごく後期に入るかもしれないし（発現量やや悪）、培養の初期に入るかもしれない（発現量超悪）。 発現プラスミドが大腸菌の生育に悪さをするような場合は、形質転換体のコロニーの大きさがコントロール（例えば空ベクターの形質転換体）に比べて小さかったり、コロニーの高さが低かったり、コロニーの色が透明だったり、コロニーを楊枝で突っつくと糸を引いたり（溶菌している）します。そのような兆候は見られませんでしたか。

(無題) 削除/引用 No.116-9 - 2009/03/02 (月) 12:09:35 - Ｑさま やはり、そうですよね。 私自身そんなことはありえないと思っていたのですが、確認できてよかったです。 みなさん、レスをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.116-8 - 2009/03/02 (月) 12:07:01 - 中年 「発現量が悪い lot は何回やっても発現量が悪い」のであれば、そのlotの発現プラスミドの精製に問題があったと考えるのが妥当でしょう。

(無題) 削除/引用 No.116-7 - 2009/03/02 (月) 12:02:51 - Ｑさま その人の説明は、「こういうことはよくある」としか・・・（笑） 発現量が悪い lot は何回やっても発現量が悪いんですとも言っていました。 腕の良いテクニカルスタッフなので、技量の問題ではないと思うのですが・・・。

Don't waste clean thoughts on dirty enzymes. 削除/引用 No.116-6 - 2009/03/02 (月) 11:52:49 - ~ その人は、そのデータを示してどのような説明をしていたのでしょうか？ 腕について疑問を持たれない人であれば、説明無しにそのようなデータを出すことは無いと思いますが。 操作の問題ではないことを示すのは難しいはずです。 蛍光タンパク質発現ベクターなどと混ぜてトランスフェクション効率を見るようなデータはあったのでしょうか。 1人が同時に2サンプルを精製、トランスフェクションしたからといって、 同じ結果になるとは限りません。 どちらかにゴミが残っていたり、トランスフェクション時の反応にムラが生じたりというのは、別にあってもおかしくは無いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.116-5 - 2009/03/02 (月) 11:51:03 - Ｑさま 同じと考えていいと思います。 やはりそのようなことはないですよね？ その人は、「こういうことはよくあるんです」と言っていて、私の経験上、ありえないと思ったのですが、一応ここでお聞きしておこうと思いまして・・・。

(無題) 削除/引用 No.116-4 - 2009/03/02 (月) 11:35:39 - AKT48 ベクターの質と量は全く同じですか？

(無題) 削除/引用 No.116-3 - 2009/03/02 (月) 07:14:37 - Ｑさま すみません、リトラ＝リトランスフォーメーションです。 つまり、均一なプラスミドをリトランスフォーメーションして、そのうち２コロニーを同じ人が増やして精製し、同じ人が同時にその２つをCOS7に入れてＷＢした場合に、発現量が５倍くらい変わってきてしまうデータを見せていたんです。 そんなことがあるのかなぁ・・・と。 COS は導入効率が高いし、同じ人が同じ日に同時に同じキットで導入しているので、「１」の可能性はないと思うんです・・・。 また、同じ人が同時に同じキットで精製しているので「２」もないはずです。

リトラ＝リトランスフォーメーション？ 削除/引用 No.116-2 - 2009/03/02 (月) 00:41:19 - ~ １．導入効率が実験ごとに異なる ２．同じキットを使っても、腕によって精製度が変わってくる 別に起きないことではではないと思いますが。 ３．形質転換して少数のコロニーを拾った場合、たまたま変異が入ったものをとってきてしまう が起きる頻度よりも、１，２の方が多いと思います。

lotによる発現差はあるのか？ 削除/引用 No.116-1 - 2009/03/01 (日) 17:42:36 - Ｑさま mammalian expression vector をリトラし、いくつかのコロニーを増やし、同じ精製キットで精製し、cell line(COS7など)に発現させたときに、発現量が著しく変わってくるということはあるでしょうか？ そのような話を聞いたのですが、どうも信じがたいのです・・・。 もしあるとすれば、どのような理由なのでしょうか？

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