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(無題) 削除/引用 No.1155-4 - 2009/09/05 (土) 14:30:55 - 名無し 細胞とAAの間の架橋反応はどのような溶液の中でおこなっているのでしょうか。培地中ですか、それともPBSのようなbufferですか。あまり自信ないのですがDSPの架橋ではたしかリジンとかのアミノ酸残基のεアミノを使うと思うのでは。だと、アミノ酸（培地とか）とかトリス（それ系のbufferとか）とかみたいなアミン関係とかたくさんあると競合してしまうからまずいとおもうのですが、その辺は問題ないですか。 あと結合部位やその近傍にそうしたアミノ酸残基が少ないとうまいこと架橋しにくいのでは。あと膜蛋白質だから、ボイル有無とかSDS-PAGEのステップも一応注意が必要かも。

(無題) 削除/引用 No.1155-3 - 2009/09/05 (土) 12:24:21 - w ＞分子間の結合は抗体を抗原に作用させた場合に比べかなり弱いと ＞思うので、反応は４℃ではなく室温や３７℃のほうが良いの ＞でしょうか。 １）細胞表面分子数が少ないからであれば、温度を上げることに幾分の効果が期待できそうです。 ２）親和性が弱いからであれば、温度を下げることで解離速度を下げることができそうです。 細胞とAAを架橋した後で、IgMでプローブは、ダメですかねぇ？

(無題) 削除/引用 No.1155-2 - 2009/09/05 (土) 10:17:23 - ぽっぽー SDS-PAGEからその後どうしたら「今のところ何も引っかかっていないのが現状です。」と言えるのでしょうか？ Ag染とかでもやってるんでしょうか？ まあ４℃と37℃とでは膜の流動性も随分違いますしね。 生理的な受容体を見つけたいのであればどちらでもやっておくべきではないでしょうか？

分子間の結合における温度の影響 削除/引用 No.1155-1 - 2009/09/05 (土) 00:36:35 - リガンダー お世話になっております。 現在、ある分子AAに対するリガンドを検出しようと試みています。 幸い手持ちの細胞株表面にFACSでリガンドが検出されたため、その 細胞株を使用しています。 しかし、今のところ何も引っかかっていないのが現状です。 行っている手順としては、 １：リガンド発現細胞株に分子AA-マウスIgG2a融合蛋白を反応（４℃） ２：リガンドと分子AAを共有結合させる目的で架橋剤DSPを添加 ３：細胞回収、可溶化バッファで溶解、遠心、上清回収 ４：プロテインGビーズで目的蛋白回収、SDS-PAGE を行っています。 分子間の結合は抗体を抗原に作用させた場合に比べかなり弱いと 思うので、反応は４℃ではなく室温や３７℃のほうが良いの でしょうか。また、現在DSPという架橋剤を使っているのですが、 他の架橋剤で良いと思われるものはあるでしょうか。 私は　http://www.funakoshi.co.jp/node/13577 上記サイトからDSPを選択しました。

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