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ありがとうございます 削除/引用 No.1152-4 - 2009/09/07 (月) 20:30:09 - まさこ リピさま 大変に貴重なアドバイスと情報をありがとうございます。 重ねてお礼申し上げます。 上司と話し合い、まずは早速 「SVの一部が抜けてしまっていないかもう一度確認」 の部分から始めようか、ということになりました。 追ってご報告申し上げます。 ありがとうございます。

失敗談 削除/引用 No.1152-3 - 2009/09/07 (月) 19:40:02 - リピ それから、SVに目的のｃDNAを組み込む際に、SVの一部が抜けてしまっていないかもう一度確認された方が良いかもしれません。 昔公開されていたSVのMAPでユニークサイトとなっている制限酵素が実は、SVの別の部分を切ってしまうことがあり、クローニングの際、SVの一部が抜け落ちてしまい、大変だったことがあったと先人から聞いたことがあります。

SVをPmeIで切ったあとに 削除/引用 No.1152-2 - 2009/09/07 (月) 19:33:34 - リピ 懐かしい話題です。私も２ヶ月ぐらい苦労しました。 SVをPmeIで切断した後に、アルホス処理後、ゲルで切り出す過程があるのですが、それを省いて、十分量のSVをエレクトロポレーションしたらうまくいきました。勿論、PacIで切ってみると、だいたい半分くらいのコロニーはいまいちでしたが。 拾ったコロニー由来のプラスミドをPacIで切る前と切った後の大きなバンドは全く同じ位置に出ていますか？ずれていたら、プラスミドをラージスケールあるいはミディアムスケールで増やし、PacIで切ると３ｋｂか４．５ｋｂのバンドが見えたことがありました。ご参考までに。

AdEasyシステムでの実験がうまくいかない 削除/引用 No.1152-1 - 2009/09/04 (金) 16:41:00 - まさこ AdEasyシステムでの実験がどうしてもうまくいきません。 Pme�TでpShuttle IRES hr GFP1を切断→泳動をしてlinealizeを確認→アルホス処理→泳動→ゲル切り出し、精製→エレクトロポレーション この手順で何度か失敗を繰り返したため、アルホス処理の後にアルホスの不活化(切り出し精製をするので無意味だとは思いますが) の手順を入れてみましたが駄目でした。 (毎度、導入するvectorは濃度を振って実験しています) ちなみにPme1で切断せずにエレクトロポレーションをしてみたら上手くいきました。 この後、stratageneに連絡をしてアドバイスいただき、以下を試してみました。 �@Pme1で切断→エタ沈→エレクトロポレーション �APme1で切断→アルホス処理→泳動→切り出し精製(UVは一切当てない)→エレクトロポレーション プレートにコロニーは生えますが、Pme�Tで切断せずに試したときには及びません。 期待を込めてコロニー(小さい物はもちろん大きいものも)を拾って増やし、Pac�Tで切断してみるものの、 サイズの大きなバンド１本だけで、本来得られるはずの3kbもしくは4kbのバンドは得られません。 何度も何度も失敗し、手を変え品を変え試してみていますが出口が見えません。 なにか間違っていることはないか、次に試してみることなど、なんでもかまいません。 なにかアドバイスいただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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