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平滑なら・・・ 削除/引用 No.1151-9 - 2009/09/05 (土) 17:43:51 - えい CIPじゃなく、BAPに変更しては？？？ ただ、フェノール処理1回のところを2回にするだけですし

(無題) 削除/引用 No.1151-8 - 2009/09/05 (土) 11:25:44 - 奴隷 すみません。誤解を呼ぶ書き方でしたが、私はベクター側をゲルに流して切り出すことはお薦めしません。全てのステップが完璧ならば何の問題ないはずですが、実際には効率が落ちてバックも増えることが多いです。ニックや末端の損傷も増えるせいだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1151-7 - 2009/09/05 (土) 11:16:48 - AP >また最近はネガコンとして、transformation を行う際、ベクターonlyでligation無しのものと、ベクターonlyでligation有りのものもplatingしていますが、両者ともかなりのコロニーができてしまいます。 すでに指摘がありますが、ligationなしでコロニーがでるならベクターの切れ残りがあるということです。それに加えて脱リン酸化に問題があるかどうかは、単位ベクターあたりのcfuを算出して、ベクターのみをligationしたものとで比較することでわかります（せっかくそういうコントロールをとっているのですから、有効に使いましょうよ）。両者、cfuがほとんど変わらないというなら切れ残りが主要な問題で、脱リン酸化はうまくいっているということですし、ligationしたほうが桁違いにcfuが高いなら、脱リン酸化が不十分でセルフライゲーションがかなり起こっているということです。 きちんとやるなら、トランスフォーメーションに使用するベクター量を一定にしておいて、菌量を一段階で10倍ずつ変えて振った（正確にやるにはそれぞれreplicateをとる）プレートで、コロニー数がある程度多く、しかもカウントできる区で計測、比較する必要があります。最近は、サブクローニングごときで、こうした基本的過ぎることは省略してしまうのが普通かもしれませんが、ビギナーやなにかトラブルがあった場合は、ちゃんと押さえておいたほうがいいでしょう。 ところで、青白選択ができる系ですよね。いくら空のベクターのコロニーが生えたとしても、白いコロニーが拾えれば先に進めるのではないですか。

(無題) 削除/引用 No.1151-6 - 2009/09/04 (金) 20:38:37 - ペーペー はい。ベクターは電気泳動で流していません。 次回はベクターも切り出して、ライゲーションに使用してみます。 平滑末端のCIP処理が効率悪いのは、初めて知りました。

(無題) 削除/引用 No.1151-5 - 2009/09/04 (金) 20:29:45 - AP プラスミドベクターの切れのこりの問題については、 ttp://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;start=6;Code=385 >両者ともかなりのコロニーができてしまいます。手中は下記のようにおこなっています。 理想的には全く出ないのがいいんでしょうが、バックグラウンドより一桁以上高いcfuがligation産物から得られれば（ligationの系がうまく動いていれば訳ないこと）、なんの問題もないんですけれどね。私は、よっぽど難度の高いコンストラクトを作る時とか、libraryを作るときでもなければ、ベクターの切り出しはしません。

(無題) 削除/引用 No.1151-4 - 2009/09/04 (金) 17:55:44 - 奴隷 切り出しをしていないのはベクター側だけですよね。 まず、ベクターは完全に切断されていますか。調製したベクター断片の一部をちょっと多めにゲルに流してそれを確認してみてはいかがですか。 また、平滑末端のCIP処理は効率が良くないので、37℃で処理した後、さらに55℃に置いています。方法はMolecular Cloningや酵素のカタログ等を参照してください。

(無題) 削除/引用 No.1151-3 - 2009/09/04 (金) 17:26:53 - ~ 制限酵素→CIP→PCI→エタ沈 ということは、電気泳動→必要なバンドの切り出しを行っていないのですよね。 無茶です。 電気泳動で見えない量でもコロニーは出来ます。 切り出しましょう。 >なにか助言など ここで質問する前に、ラボの先輩や教員に相談しましょう。

(無題) 削除/引用 No.1151-2 - 2009/09/04 (金) 17:21:12 - ばいや ligationなしでもコロニーが出てくるということなので切れていないのでは？ 制限消化後に切断の確認を！

何故か、ライゲーションが上手くいかない 削除/引用 No.1151-1 - 2009/09/04 (金) 16:36:56 - ペーペー 学士４年のものです。 　現在、ベクター pBluescript SK+ (3.0Kbp)に7Kbpのinsertとで平滑末端のライゲーションを行っています。最近になってmolecularの実験を初めたのですが、なかなか上手くいかず2ヶ月がたってしまいました。 3kbpくらいのinsertなら成功したことはあるのですが、7kbpともなると・・・。なにかコツなどがありましたら、是非聞かせてください。 また最近はネガコンとして、transformation を行う際、ベクターonlyでligation無しのものと、ベクターonlyでligation有りのものもplatingしていますが、両者ともかなりのコロニーができてしまいます。手中は下記のようにおこなっています。 ベクターを調整する際、まずEcoRVで４時間（overnightもしてみました）。このとき、bufferはＮＥＢの３（H buffer）を使用します。 ４時間経過したら、ベクターの脱リン酸化の為にＮＥＢのＣＩＰを1μL（2μL でもやってみました）入れて、1時間インキュベートします。 その後フェノクロ抽出→エタ沈という流れで、ベクターを回収します。 この方法に何か問題はあるでしょうか？またなにか助言などがありましたら是非教えてください。

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