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多波長は？ 削除/引用 No.1150-8 - 2009/09/07 (月) 10:16:30 - 周りに誰もいない ROXに関しての御指摘は「しなくても良いかもしれないが、少なくともROX補正するにこしたことはない」と、理解いたしました。 結局、SYBRとROXを見るために2波長必要、ということですね。 ところで、それ以外の多波長の使用実験に関しては、どんな実験系があるのか、実際にされている方、分かりやすく教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1150-7 - 2009/09/05 (土) 08:26:18 - jk タカラは使ったことないのですが、ROX補正せずに2nd derivative maximum法とかでCtを算出するんじゃなかったでしょうか。実際には、各wellから検出器までの光路差はバラバラなのでROX補正をしなければならないのに、これを2回微分法とかで理論上補正しなくて良い、とするようですが、どうなんでしょうね。仮にwellから検出器までの距離が同じでもROX補正は重要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1150-6 - 2009/09/04 (金) 21:55:39 - ザンギ ROX補正はピペッティングエラーの補正にも有効なようですが、原理を理解 していないので断定的なことは言えませんが、完全に補正しきれるものでも ないような気がします。 ROX補正は出来るに越したことはないけれど、どうしても必要とも思えませ ん。 それよりも温度の制御の均一性だとか、光学的な性能のほうが重要な気が してます。

ありがとうございます 削除/引用 No.1150-5 - 2009/09/04 (金) 20:46:25 - 周りに誰もいない 皆様、御丁寧に御説明いただき、ありがとうございます。 各条件下で組織、細胞からtotal RNA抽出、逆転写、リアルタイムという流れで、対象の遺伝子もごくごく一般的なものを扱っています。 機種によって条件検討からして異なる、ということですね。 一般論として、ROX補正しなくても論文、学会的には問題ないのでしょうか？ （もちろんマスターミックス作成、最低トリプリケートで行っています） 波長に関しては未だによく理解しきれていません。 波長が多いと途端に価格が跳ね上がるので、割り切って1波長機種を買ってもらうようお願いしてみてもいいのか、せめて2波長のものを買わないと何か困ることがあるのか、どうなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1150-4 - 2009/09/04 (金) 17:23:21 - R 参考までに 1. リファレンスジーンも同一wellで測定できるのでより正確になると聞いています。 2. ROX補正は、手ぶれ補正のためにあるのですか？ ブロック式機種の性質に依るものだと理解していました。 別のトピでも手ぶれ補正のために行うみたいな感じの書き込みを見かけましたが。 5. R社のローター式、ブロック式両方を使用していますが、精度に差はなさそうです。一度、同じサンプルで試験しましたが、ほとんど差はありませんでした。

passive referenceと機種での差について 削除/引用 No.1150-3 - 2009/09/04 (金) 16:35:35 - go 経験談です。 機種名省略しますが、ロシュとストラタの機種を使っております。 ロシュではROX不要とのことでこちらではROX補正を行っておりません。 どちらの機種でも発現量解析に問題はなく、同じプライマーを用いて一応同じような結果が得られます。ただ、SYBRgreenの試薬との相性？があるようで、それぞれの機種では異なるMasterMixを使用しております。アニーリング温度等の条件検討した結果、それぞれの機種で最適条件は異なりました。単純にキャピラリー型とプレート型で測定方法が異なるため、得手不得手があるのだろうと軽く考えておりました。 どんな実験をするかにもよると思いますので参考までに。 ちなみに私は組織からtotalRNAを抽出、逆転写の後、目的タンパク質の発現量を解析するというオーソドックスな実験をしております。

(無題) 削除/引用 No.1150-2 - 2009/09/04 (金) 16:11:12 - Pumpkin 私は、4波長機を用いていますが、SYBRによるインターカレート方式でqPCRをしており、今のところそれしか行わない予定ですのであまり参考にならないですが。。。 2．マスターミックスを作る、テクニカルレプリケートを作る等ブレには気をつけていますが、ROX補正も行った方がいいと思います。ROX補正がいらないという機器も出ているようですが、使ったこともありませんし、ありなしで検討した経験もないので何とも言えません。個人的にはROX補正は重要だという認識でいます。 3．私の場合はROX補正できないので、1波長は選びません。 4．PCR機（機種が同じであっても）によって増幅効率が違うことは当たり前の認識なので多少の早い遅いはあるでしょう。でも、例えばマイクロアレイとPCRというように原理がことなる方法で比較しているわけでないので、最終的な結果に違いはないと考えるのが正当ではないでしょうか。 5．これは最近同様のログが出ているので、参考にしてください。

リアルタイムPCRの波長 削除/引用 No.1150-1 - 2009/09/04 (金) 15:09:30 - 周りに誰もいない 時々しかリアルタイムPCRを行わず、同じ研究室内でリアルタイムPCRをしているのが自分一人なので、研究室では購入してもらえず、その都度空いている他の研究室でリアルタイムPCRの機械をお借りしております。 実際SYBR　Green IかFAMしか使っておりませんので１波長のみしか使用しないのですが、お借りしている機種の中には1波長のみ（Ｂ社）、2波長（T社）、中には5波長（A社）という機種もあるのですが、どの研究室の方も実際にはSYBRかFAMしか使用していないそうで、多波長機能については詳しい方がおられません。将来の購入を期待して機種や性能を勉強しているのですが、具体的なことが分からないのです。 そこで基本的な御質問で恐縮ですが、 1．多波長の機能は実際どのような時に使用するのでしょうか？マルチプレックスでレポーターの蛍光波長の違うものを用いる、ジェノタイピングの時、には多波長必要ということでよろしいでしょうか？実はもっと他にもいろいろとあるのでしょうか？ 2．ROX補正不要（もしくはできない）、という機種は、本当に手ぶれを考慮しなくていいような仕組みや理論があるのでしょうか？それとも、可能な限りROX補正を行うべきなのでしょうか？ 3．（御質問1と重複するかもしれませんが）１波長の機種だと困る実験系とはどのような時でしょうか？　 4．同じ実験系では同じ機種をお借りするようにしておりますが、機種が異なれば機器の性質の違いから当然結果も異なるという判断でよろしいのでしょうか？ 5．R社、Q社のローター式が非常に結果が精密だと聞きましたが、ブロック式とそれほど異なるものなのでしょうか？（ブロック式しか使用したことがありません）ランニングコストが高い、というお話もお聞きしましたが、実際には何が高いのでしょうか？ 以上、初歩的な御質問ばかりで恐縮ですが、お聞きできる方がおらず困っております。御時間をお取りして申し訳ございませんが何卒よろしくお願いします。

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