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(無題) 削除/引用 No.115-5 - 2009/03/01 (日) 22:56:01 - f SP-sepharoseはイオン交換担体ですね。

(無題) 削除/引用 No.115-4 - 2009/03/01 (日) 17:23:19 - genji どれくらいアプライしているかわかりませんが、キャリーオーバーしているか、吸着力が弱いのだと思います。 カラムのサイズをもっとスケールアップするか、硫安でタンパク質落としたり、ゲル濾過を最初のステップにしたり。 イオン交換を最初のステップにもっていくなら、fさんのおっしゃる通り、pHやイオン強度も重要ですね。

(無題) 削除/引用 No.115-3 - 2009/03/01 (日) 15:41:16 - A 以前昆虫細胞で蛋白質を発現させて精製していました。 体積が多い場合は５Lのバッファーでいいので半日毎の バッファー交換で３日ほど行なえば培地成分はほぼ抜けます。 もし窒素ガスによる限外ろ過装置が使えるのであれば日中に 濃縮して一晩透析すればカラムにかけられます。

(無題) 削除/引用 No.115-2 - 2009/03/01 (日) 14:02:58 - f サンプルや平衡化バッファーのイオン強度が強いとタンパク質の吸着量は 当然低下するので、ご自分でお書きの様にバッファーで透析するのが良い かと思います。また、目的タンパク質の等電点はご存じですか？それに 従ってサンプルpHや平衡化バッファーpHを決めないと、効果的な結合は 得られません。1Ｌ程度のサンプルに特別な装置は必要ありません。透析チューブを買って、やってください。

カラムの素通り 削除/引用 No.115-1 - 2009/03/01 (日) 10:48:08 - みゆ 昆虫細胞で大量発現、分泌したたんぱく質の精製を行っています。 第1段階として部分精製＆濃縮のために、SP-sepharoseを行っており、精製はできているのですが、素通り画分を見ますと結構な量が漏れていました。 カラムサイズを少し大きくしてみたのですが、やはりアプライの時点でかなりピークが振り切れているので、カラムのキャパを超えているように思います。 元々のサンプルに含まれる培地成分（沢山のアミノ酸が含まれていますよね？！）を抜いてから、アプライした方がいいのでしょうか？あるいは、pHを平衡化Bufferに同じにしたり、希釈した方がいいのでしょうか？ 現在の方法は、分泌タンパク質を遠心分離し、その上清をフィルターろ過して、そのままアプライをしています。 何かの資料で、平衡化bufferで透析（置換）してから行っているのを見たことがあるのですが、500mL〜１Lサイズを透析する装置がないので、困っています。（小容量の透析膜はあるのですが・・） 素通りする原因＆対策方法などのアドバイスがございましたら、教えていただけますでしょうか。お願い致します。

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