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(無題) 削除/引用 No.1146-9 - 2009/09/04 (金) 20:19:35 - フィッシュ >[Re:8] あかねさんは書きました : > まさにAPさんの仰るとおりです。 > リピート配列を検出するときはCot1はssDNAのような競合のためのDNAは入れてはいけません。 > 繰り返し配列のプローブのみでハイブリさせます。 あかね様 　かきこみありがとうございます。 Cot1だけでなくサケのスパームのDNAも入れてはいけないのですね。ありがとうございます。ぜひ参考にさせていただきます。 お二人ともこの度はご指導ありがとうございました。とてもためになりました。

(無題) 削除/引用 No.1146-8 - 2009/09/04 (金) 16:42:18 - あかね まさにAPさんの仰るとおりです。 リピート配列を検出するときはCot1はssDNAのような競合のためのDNAは入れてはいけません。 繰り返し配列のプローブのみでハイブリさせます。

(無題) 削除/引用 No.1146-7 - 2009/09/04 (金) 15:54:41 - フィッシュ > この考えでいくと、とうぜん反復配列を検出しようと言うときは、そう言う操作は不必要、というより有害なんではないでしょうか。 > AP様 　 　早速のご返答ありがとうございます。 とても分かりやすいご説明ありがとうございます。おっしゃる通り本件があてはまるかどうかは定かではないのかもしれませんが、とても分かりやすく、良い勉強になりました。反復配列をプローブとして使うかあるいはユニークな配列をプローブとして使うかによって手法が異なるということは、抑えておかなければならない知識だと思いますので、とてもためになりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1146-6 - 2009/09/04 (金) 14:53:53 - AP >書き込みありがとうございます。 >広い範囲のプローブだとハイブリして欲しくない領域が含まれてしまうこともあるということでしょうか？反対に短いリピートの反復配列に対するプローブを用いる場合はこのプレアニーリングはしない方が良いと考えるのが妥当でしょうか？ 本当に、反復配列をブロックするためかどうかは、そのプロトコールにある記述を見ないことには、私には確信が持てないですけれど、 一般的にBACのような長いDNAクローンには、サテライトのようにゲノムのあちこちに散在し、タンデムで高度に反復しているrepetitive sequenceが含まれる場合がほとんどです。こういうのをプローブにすると、染色体上のいろいろなところが光り、そのプローブがマップされる正規の位置がわからなくなったりします。 そのような反復配列の繰り返し単位は短く、コピー数はむちゃくちゃ多いです。そういうDNA断片はアニール/ハイブリする速度が、ユニークな配列（ゲノムに一コピーのような）にくらべて非常に速い、つまり低いCot値をもちます。 ですから、あらかじめ適当な条件でアニール操作をすると、反復配列が選択的に二本鎖に戻りプローブとして働かなくなる一方、ユニークな配列は大部分が一本鎖のまま残ると期待できます。 この考えでいくと、とうぜん反復配列を検出しようと言うときは、そう言う操作は不必要、というより有害なんではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1146-5 - 2009/09/04 (金) 11:29:57 - フィッシュ >[Re:3] あかねさんは書きました : > APさんの言うとおりです。 > 反復配列同士をアニールさせて、ユニークな配列のみがゲノムにハイブリするよう仕向けるのです。 > プローブと一緒に過剰のCot1等を入れてますよね。 あかね様 　書き込みありがとうございます 　反復配列をクエンチさせるの意味がよく分からなかったのですが、説明を細くして下さったことで理解することができました。 　確かにプロトコールではコンペティターとしてサケのDNAとCot1を入れろとあったのですが、Cot1については勉強不足なのですが、繰り返し配列のブロッキングに使われるものと認識しています。ということは、セントロメアやペリセントロメア、あるいはテロメアのような繰り返し配列に対するFISHを行うときは入れない方が良いということなのでしょうか？ 　いくつも御聞きして申し訳ありませんがよろしく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1146-4 - 2009/09/04 (金) 11:22:41 - フィッシュ >[Re:2] APさんは書きました : > 私もそういう手法は初耳なんですが、ひょっとすると、どういうプローブを想定したプロトコールかというのがポイントかもしれません。BACなどゲノムの広範囲を含む長いプローブではないですか。反復配列をクエンチする操作だとすると筋が通りそうですが。BACなんかをプローブにする場合は、反復配列をいかにブロックするかがポイントだったりしますので。 APさん 　書き込みありがとうございます。 　広い範囲のプローブだとハイブリして欲しくない領域が含まれてしまうこともあるということでしょうか？反対に短いリピートの反復配列に対するプローブを用いる場合はこのプレアニーリングはしない方が良いと考えるのが妥当でしょうか？ 　以上宜しくご指導御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1146-3 - 2009/09/03 (木) 22:45:53 - あかね APさんの言うとおりです。 反復配列同士をアニールさせて、ユニークな配列のみがゲノムにハイブリするよう仕向けるのです。 プローブと一緒に過剰のCot1等を入れてますよね。

(無題) 削除/引用 No.1146-2 - 2009/09/03 (木) 22:12:52 - AP 私もそういう手法は初耳なんですが、ひょっとすると、どういうプローブを想定したプロトコールかというのがポイントかもしれません。BACなどゲノムの広範囲を含む長いプローブではないですか。反復配列をクエンチする操作だとすると筋が通りそうですが。BACなんかをプローブにする場合は、反復配列をいかにブロックするかがポイントだったりしますので。 操作を書き並べただけで、原理に基づいた解説がないのは、いい教科書ではないですね。

FISH法のプローブについて 削除/引用 No.1146-1 - 2009/09/03 (木) 18:32:07 - フィッシュ いつも勉強させていただいております。 今度初めてFISH法を行おうと計画をしております。 実験プロトコール集を読んだところ、 DNAを80℃で変性させ、素早くアイスブロックに移して冷却する。 　　　　↓ 等量のハイブリバッファーを加え混合する 　　　　↓ 37℃のヒートブロック上で30分以上プレアニーリングする。 とあったのですが、このプレアニーリングとはどういう目的で行う行程なのでしょうか？ アニールさせてしまったら、ターゲットにハイブリダイゼーションしなくなってしまうのではないか？と思い、質問させていただきました。 基本的な質問で申し訳ありませんが、どなたかご指導をよろしく御願い致します。

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