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(無題) 削除/引用 No.1144-10 - 2009/09/03 (木) 13:52:56 - バイオ初心者 ＞pumpkin様 使っているモノが同一なので大変参考になりました。ありがとうございます。 ＞奴隷頭様 今回は5回できれば良いなと考えております。ありがとうございます。 ＞AP様 DIGでは20回という例もあるのですか。すごいですね。ECLはDIGに比べると感度は悪いと聞いております。 固定はUVで行っております。 deprobingは必要ないとの記述がメーカープロトコルにございましたので行っておりません。またプローブも毎回別のものを使うのでdeprobingの必要性は低いかと考えているのですが、いかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1144-9 - 2009/09/03 (木) 13:16:28 - AP 生物種とかプローブとかより、重要なファクターは「メンブレンの品質」「ターゲットDNAの固定方法」と「deprobingの方法」だと思います。副次的には、だんだんターゲットもはがれたり劣化したりしてきて検出しにくくなるので、検出系の感度の高さも効いてくるでしょう。 DIGシステム（Roche）ですが、ハンドブックによると、指示された方法に従って適切に行った場合、最大20回という例もあるそうです。 個人的には、Amersham（現GE）のメンブレンも核酸ハイブリ検出系も信頼していないいし、使っていないので、どういう方法でdeprobeするといいかとか情報を持ちませんが（おそらくアルカリ溶液で処理するというのが良いんだとは思いますけれど）アドバイスするとすれば、reprobingすることを前提にしているなら、DNAの固定をUV-cross linkにすると良いです。

(無題) 削除/引用 No.1144-8 - 2009/09/03 (木) 13:09:19 - 奴隷頭 ゲノムサイズの小さい酵母なら５回くらいは何の問題もないでしょう。バンドが出てそのサイズが分かりさえすればよいと言うことであれば、10回でも大丈夫だと思います。だんだん汚くはなってくるでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.1144-5 - 2009/09/03 (木) 13:05:03 - Pumpkin 同じキット、同じメンブレンで4回までリプロービングしたことあります。まだできそうな感じでしたが、シグナルはだんだん弱くなってきている感じはありましたよ。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1144-4 - 2009/09/03 (木) 12:58:20 - バイオ初心者 プローブは500bpのPCR断片で作製しています。

(無題) 削除/引用 No.1144-3 - 2009/09/03 (木) 12:57:07 - バイオ初心者 申し訳ありません。基本的な事項を書き忘れておりました。 生物種は出芽酵母S.cerevisiaeです。

(無題) 削除/引用 No.1144-2 - 2009/09/03 (木) 12:50:19 - 奴隷頭 生物は？

サザン繰り返しリプローブの限界 削除/引用 No.1144-1 - 2009/09/03 (木) 12:30:57 - バイオ初心者 いつも勉強させていただいております。 現在、サザン解析を行っております。 一度バンドを検出した後、別のプローブを用いてリプローブし再びバンドを検出しました。 このように同じメンブレンを用いて別のプローブで（または同じプローブで）繰り返しリプローブする場合、何度くらいまで良好な結果が得られるものなのでしょうか？ご存知の方、よろしくお願いします。 因みに、メンブレンはHybond-N+、検出キットはGEヘルスのECLキットを用いています。

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