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たびたびすみません 削除/引用 No.1141-16 - 2009/09/10 (木) 12:30:14 - GFP初心者 みさん 細胞を染色するとのことですが簡単にプロトコールをご紹介お願いしたいのですが、できましたらお願いします。 たびたび本当にすみません。

(無題) 削除/引用 No.1141-15 - 2009/09/08 (火) 18:37:14 - み > みさん、細胞をanti-GFPで染色していたとのことですが、用いた抗体は１種類ですか（１次、２次という意味です）？また、フローサイトの実験は行いましたか？ １次としてanti-GFP rabbit Ab(クロンテック）, ２次としてanti-rabbit Goat Ab-FITC フローサイトは行っていません。

返信遅れて、すみません。 削除/引用 No.1141-14 - 2009/09/08 (火) 15:25:22 - GFP初心者 みさん 私用で返信できませんでした。すみません。 細胞に導入した際に、高次構造の保持率が崩れて、効率よく光らないのかもしれません。細胞を何種類か振り分けて行ってみようと思います。ちなみに今用いている細胞はB16細胞です。 ペプチドにはCPPとして頻繁に用いられているTATペプチドを使用しています。 あとはシアル酸認識を持つペプチドを用いています。 みさん、細胞をanti-GFPで染色していたとのことですが、用いた抗体は１種類ですか（１次、２次という意味です）？また、フローサイトの実験は行いましたか？

(無題) 削除/引用 No.1141-13 - 2009/09/03 (木) 14:03:49 - ばいや 通りがかりさん、みさん 参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1141-12 - 2009/09/03 (木) 13:27:42 - み 膜透過性ペプチドにGFPまたは55kDaの蛋白を融合した大腸菌リコンビナント蛋白を細胞にふりかけて導入したことあります。 サイズは問題ないですよ。 5年前の時点での話ですが、原理はエンドサイトーシスではないか？と書いていた論文がありました。 NGF無処理PC12細胞には導入されなくて、処理したものには入るとのデータもあったので、分化後細胞にはレセプターとなり得るものが細胞表面に誘導されているのでは？とも記載されていました。 GFPfusionリコンビナント蛋白を精製すると、確かにチューブ内で緑色に光っているけど、細胞内に導入した段階でそんなに効率よく光るものなのでしょうか？高次構造なんかの保持率も低くなっているだろうし・・・。 僕は導入後、anti-GFPで染色して確認していましたけどね。

(無題) 削除/引用 No.1141-11 - 2009/09/03 (木) 13:13:21 - 通りがかり CPP (cell-penetrating peptide) と呼ばれる一群のペプチドを付けると、大きなタンパクでも直接細胞に取り込まれうる事が知られています。山中カクテルの各タンパクを CPP fusion にして細胞にふりかけ、iPS 細胞を作った論文なども出ています。Klf4 なんて 65kD もありますが。 当然ながら効率は個々のペプチドによって違うでしょうし、ターゲットの細胞によっても、あるいは fusion の相手によっても違うでしょう。多くの場合、まず GFP fusion を作ってテストするので、発表されているものは GFP ではうまく行く場合が多いです。 そういった既知のペプチドと報告された細胞を使って、まずは実験系そのものの再現性を確認してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1141-10 - 2009/09/03 (木) 12:20:56 - DC 目的のペプチドは膜透過性との事ですが、GFPなんてドデカいタンパクを融合させていれば透過性なんてなくなってしまうのではないでしょうか。 膜透過性、というのがレセプターを介したエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれる、というのであればもしかするとGFP融合ペプチドでも取り込まれるのかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1141-9 - 2009/09/03 (木) 09:05:34 - ばいや 知らないのですが、GFPが膜を透過するって報告はあるのでしょうか？ GFPは大きいし、本来膜を透過するタンパク質ではないし、蛍光を出すためにはGFPの立体構造が重要だったりします。 GFPを融合して局在を調べたものでも、シグナル付はよくわからない状況になっていたといううろ覚えがあります。 GFPではなく、蛍光を発する化合物を融合してみては？

(無題) 削除/引用 No.1141-8 - 2009/09/03 (木) 04:27:38 - Boston 面倒かと思いますが，哺乳動物細胞でワークするベクターに置き換えて、トランスフェクションして蛍光があるか確認する必要があるかと思いますーもし点変異を気にされておられるのであれば。 あと、N-、C-末端とで、シグナルペプチドの活性が変わるかもしれませんね。ご自身で指摘されておられるようにマスクされている可能性は十分にあります。

(無題) 削除/引用 No.1141-7 - 2009/09/03 (木) 02:45:05 - おお >[Re:1] GFP初心者さんは書きました : > 　タンパク質濃度は、分光蛍光光度計を用いて測定しています（FITCで検量線を引いています）。AcGFPの蛍光極大波長の理論値は、505nmなのですが、509nmで観察されます。変異が原因でしょうか。。。 変異がどこまで影響しているかはちょっと分かりませんね。 波長のシフトは環境で変わったりしますので、大きなズレで なければまずよしと考えて良いのではないでしょうか。 > > 　最終的に、このGFP融合ペプチドを細胞に投与し、共焦点顕微鏡で観察すると蛍光はほとんど確認できません。 > > 　ちなみに、GFPの光は精製段階でとてもきれに観察できます。 膜透過性のペプチドと融合しているのでしょうか、FITCでは うまく行くようですが、GFPはそれよりはるかにでかいので、 それが影響しているかもしれません。 インキュベーション時間を長くするとかで若干よくなるかもしれませんが 期待できるかというとよく分かりませんね。あとはFITCの時より 濃度を上げるとか。 思い切ってエレクトロポレーションとか、タンパク導入用の試薬などを 使ってみたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1141-6 - 2009/09/03 (木) 01:36:24 - GFP初心者 TSさん GFPに融合しているペプチドが膜透過性です。 導入方法は、細胞に添加（アプライするだけ）して、37℃でインキュベートしています。ペプチドが膜透過性なので、通過するはずなのですが。。。（涙） この実験系の前にはFITC標識して細胞に添加していたのですが、その時はきれいに見えてました。 笑い男さん ガラスボトムディッシュを使用しています。GFPだけを添加して観察しましたが、画面が緑色になりました。 GFPが細胞透過性ペプチドの機能を消しているとか。

(無題) 削除/引用 No.1141-5 - 2009/09/03 (木) 00:25:58 - 笑い男 　膜透過性のペプチドで細胞外に振りかけて、細胞に入るかどうかー？なんて勝手に妄想しつつ・・・ 　細胞の無い状態で、精製したであろうGFPをカバーガラス上？にでも垂らしたら、蛍光は観察されますか？ 　共焦点顕微鏡の使い方に問題は無いですよね？

(無題) 削除/引用 No.1141-4 - 2009/09/02 (水) 20:59:50 - TS お聞きし忘れましたが、「細胞に投与」というのは、マイクロインジェクションのような手法でしょうか？ 27kDa GFPは、通常は細胞内に入らないと思うのですが、その融合ペプチドがあると細胞内に導入されると考えられるのでしょうか？ 単に入っていないだけ、ということではないと考えて良いのですよね？

(無題) 削除/引用 No.1141-3 - 2009/09/02 (水) 20:19:51 - GFP初心者 TSさん 固定はしていません。

(無題) 削除/引用 No.1141-2 - 2009/09/02 (水) 20:16:23 - TS 固定してるんでしょうか？ 固定すると、蛍光は減弱しますね。 もしくは、固定が可能であれば、固定後、Anti-GFPでグリーンに免疫染色。

GFP 光らない（涙） 削除/引用 No.1141-1 - 2009/09/02 (水) 18:05:46 - GFP初心者 　こんにちは。初めて投稿させていただきます。 　GFP融合ペプチドを細胞へ投与し、目的のペプチドの細胞内での局在を観察する実験を行っています。 　GFP融合ペプチドはpAcGFPというベクターにペプチド配列とHisタグを入れて、大腸菌で発現させて精製という手順で行っています。しかし、AcGFPの配列の１カ所に塩基配列の変異が入っています。。。 　精製は、Hisカラムに通し（SDSで確認するとまだ複数バンドがある）、spin カラムで濃縮、バッファー交換という手順で行っています。 　タンパク質濃度は、分光蛍光光度計を用いて測定しています（FITCで検量線を引いています）。AcGFPの蛍光極大波長の理論値は、505nmなのですが、509nmで観察されます。変異が原因でしょうか。。。 　最終的に、このGFP融合ペプチドを細胞に投与し、共焦点顕微鏡で観察すると蛍光はほとんど確認できません。 　ちなみに、GFPの光は精製段階でとてもきれに観察できます。

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