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タンパク質の脱リン酸化処理について 削除/引用 No.1137-11 - 2011/02/22 (火) 11:20:18 - phospho

(無題) 削除/引用 No.1137-10 - 2009/09/04 (金) 01:42:22 - ねうろん >>中年さん の後半の意見に賛成です。 出来ない事はないけど、、、って感じですね。lysate中のphosphatase活性って相当高いと思いますし。例えば逆に脱リン酸化をみるためのソースとしてcrudeな細胞抽出液を使ったりしますし。これはかなりよくworkします。 ですからその実験をするにあたってはBuffer条件もかなり重要だと思います。ATP、Mg、phosphatase阻害剤、pH、塩濃度、etc、、、。かといって結果が得られたとしても解釈が難しそうですね。 いっその事ライセートをインキュベートしてリン酸化から脱リン酸化への反応をみるというのは。あ、でもそしたらリコンビナント使わないし質問の意味が無いか、、、

(無題) 削除/引用 No.1137-9 - 2009/09/02 (水) 12:35:17 - 中年 TSさんが仰っているのは、今お使いの抗リン酸化セリン／スレオニン抗体で（あるいはその他のこれから使おうとしている検出試薬で）問題のリン酸化を検出できるかどうかを検討するためのポジコンとして、細胞から取ってきたリン酸化されたそのタンパク質を使えば良いのではないかということだと思います。 それから、全く分画していないlysateをそのままキナーゼのソースとして用いるのは無理があると思います。キナーゼの量が少なすぎますし、特異性の低いホスファターゼも沢山含まれているし、ATPを分解する酵素も入ってるだろうし、他の活性の強いキナーゼ（Ａキナーゼなど）によるリン酸化で意味のあるリン酸化はマスクされちゃうだろうし。

(無題) 削除/引用 No.1137-8 - 2009/09/02 (水) 10:24:55 - おお >[Re:7] ともさんは書きました : > 他に何かリン酸化を見る方法って知っていますか？ > 私が見たことあるのが、phos-tagとリン酸化タンパクの染色試薬くらいです。感度がどのくらいなのか不明で使用したことはありません。 > リン酸化タンパクの染色試薬で検出できるなら楽かもしれませんが どうなんでしょうね。どの程度有効なのか分かりません。 たのグループが燐酸かを示しているようでしたら、脱燐酸かの 方法は樹立されていませんか? その方法でリコンビナントを脱燐酸か処理をして、phos-tagで移動度 に変化があるかをみるとかすればいいかもしれません。 同様の発想で燐酸かタンパクをトラップできるカラム(レジン)を 使ってみるのもいいかもしれませんね。 それで脱燐酸か処理をしたものと比べて移動度または吸着力 が変化すれば、燐酸かしているといえるしそうでなければ 証明とまで行きませんが、燐酸化してないだろうという 考えで実験を進めていけるかもしれません。 phos-tagは燐酸か依存の移動度がかわるので、コントロールとの 比較をそのターゲットに対する抗体で検出し比較すれば 何とかなるような気がしますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1137-7 - 2009/09/02 (水) 09:25:01 - とも みなさんお返事ありがとうございます。 中年様 ＞抗リン酸化セリン／スレオニン抗体は配列依存性が大きい場合が多くて、 そのことは知りませんでした。 方法を変えて検出しないといけないかもしれませんね。 TS様 ＞目的タンパク質を発現する細胞から、IP, IB: pT, pSで、リン酸化が確認できるのでしょうか？ 私自身は行っていません。10年くらい前からリン酸化はされると言われていて何報か論文も出ています。しかしその方法はRIや2Dを用いた方法です。 私自身で検出したいのですが、RIや2Dなどが使える環境にありません。もし方法がないのなら、外部の研究室でやらせてもらうか検討しようかと考えています。 あかね様 ＞g32P-ATPを使って実験された方が、感度もデータの質も上がるのでは？ RI使いたいのですが、今現在使用できる環境ではありません。 他に何か検出方法ご存知ですか？ あきら様 ＞私ならlysateにkinase活性がないことを疑います それはなぜですか？ よく論文で見かけるのですが、kinaseがわかっている場合、そのkinaseをIPして、そこにATPとタンパクを入れてリン酸化を見ている人がいます。 私の場合kinaseがわからないのでlysateを使用しました。 もしよかったらこの方法の考えられる欠点を教えてください。 おお様 ＞コントロールがないと結論が出ないですね。 私もそう思います。しかし、ポジコンがないのが現状です。 ＞RIを使うかもしくは2Dなど駆使して、いろいろな観点から考察していく 必要があるかもしれません。 上でも書きましたが、今はそれができません。 他の数グループはその２つの方法でリン酸化されているということを証明しています。 他に何かリン酸化を見る方法って知っていますか？ 私が見たことあるのが、phos-tagとリン酸化タンパクの染色試薬くらいです。感度がどのくらいなのか不明で使用したことはありません。

(無題) 削除/引用 No.1137-6 - 2009/09/02 (水) 00:44:14 - おお 大腸菌リコンビナント(マンマルのタンパク)が大腸菌で合成した時に 燐酸かが起こっていたという例を2つほど論文で見たことがあります。 例外中の例外かもしれませんが、今まで燐酸かされないという前提 で実験しているだけで気が付いてないものがあるのではと思うように なってきています。 >その結果、lysateを入れても、入れなくても同じ濃さのバンドが検出されました。これはやっぱり、大腸菌内でリン酸化されていると思っていいのでしょうか？ これはコントロールがないと結論が出ないですね。 厳密なコントロールを設定するのはちょっと難しいかもしれませんが、、、 RIを使うかもしくは2Dなど駆使して、いろいろな観点から考察していく 必要があるかもしれません。

lysate 削除/引用 No.1137-5 - 2009/09/01 (火) 22:34:49 - あきら 私ならlysateにkinase活性がないことを疑います． 大腸菌のリン酸化酵素は基本的に特異性が高いので 心配する必要はないと思います． 抗体の問題はポジコンをとれるなら判断できると思います．

(無題) 削除/引用 No.1137-4 - 2009/09/01 (火) 21:41:19 - あかね リコンビナントたんぱく質がリン酸化されているかどうかはケースバイケースと思いますが、 この場合抗体ではなくg32P-ATPを使って実験された方が、感度もデータの質も上がるのでは？

(無題) 削除/引用 No.1137-3 - 2009/09/01 (火) 20:43:59 - TS 大腸菌内ではリン酸化されない、に一票です。 通常、「されていない」ことを前提で実験する場合が多いと思います。 中年さんがおっしゃるとおり、Anti-pT, pSは、認識できる配列が限定的ですよね。その辺は、大丈夫でしょうか？　たとえば、目的タンパク質を発現する細胞から、IP, IB: pT, pSで、リン酸化が確認できるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1137-2 - 2009/09/01 (火) 17:34:34 - 中年 そのタンパク質がキナーゼ活性を持っていないなら、普通は大腸菌内ではリン酸化されないでしょう。そのタンパク質に大腸菌のホモログが存在して、活性の制御にいたるまで良く似た振る舞いをするというならあるかもしれませんが。もちろん例外はいつでもあり得ることですが。 抗リン酸化セリン／スレオニン抗体は配列依存性が大きい場合が多くて、あるタンパク質のリン酸化は検出できても他は全然ダメということが良くあります。リコンビナントタンパク質をCBBで見えるくらいの量用いているなら、ご覧になっているバンドは単なるノンスペではないでしょうか。

リコンビナントタンパクのリン酸化 削除/引用 No.1137-1 - 2009/09/01 (火) 17:00:05 - とも 今あるタンパクのリン酸化サイトの検索を行っています。 in vitroの実験系をやるため、そのタンパクのリコンビナントタンパクを作製したので、それを使ってリン酸化も見れないかなーって思って実験しています。 そこで経験のある方に教えてほしいのですが、大腸菌の中でリコンビンナントタンパクのリン酸化って起るのですか？ またそれは哺乳細胞と同じサイトで起りますか？ 今現在行っている実験は、細胞のlysateにATPとリコンビナントタンパクを入れて、30℃でインキュベーションして、リコンビナントタンパクを精製し、Anti-p-ser,thrでウエスタンを行っています。 その結果、lysateを入れても、入れなくても同じ濃さのバンドが検出されました。これはやっぱり、大腸菌内でリン酸化されていると思っていいのでしょうか？ もし経験や人から聞いたでもよいのですので、教えてください。

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