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(無題) 削除/引用 No.1134-7 - 2009/09/02 (水) 20:39:41 - 組織 >1回目の時は抗体は細胞外domainなのに、核も、細胞質も、全体も緑色に染色できた そもそも非特異的なシグナルをみているような気がしますね。レセプターがのっぺりと細胞全体に染まるというのはちょっと考えにくいように思えます。もし同じ1次抗体を使った論文をお持ちなら、その染色像と比較してみて下さい。 >その後はbackもまったく真っ暗になってしまいました >昨日の標本を本日再度観察していたら、昨日は真っ暗だったものが緑色に淡く染色されていました これもコンフォーカルのセッティングの違いで、レーザーが弱いときはバックが消えて、強くしたらバックとして全体が光った、というように思えます。 他の方からもご指摘がありますが、その1次抗体がワークしているかは確認されてますか？

(無題) 削除/引用 No.1134-6 - 2009/09/02 (水) 19:51:49 - AP >4) 0.6%H2O2＋メタノール ( 100μl H2O2, 4900μl メタノール) 20分 これはなんのため？ peroxidase標識抗体で検出するときに、内因性peroxidaseを殺す操作のように見えますが、FITC検出では必要ないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1134-5 - 2009/09/02 (水) 19:44:23 - 通りがかり 自家蛍光じゃないすか？

(無題) 削除/引用 No.1134-4 - 2009/09/02 (水) 19:35:39 - VEGFR-1 アドバイスありがとうございます。2次抗体はmouseに対するものです。 その後、昨日の標本を本日再度観察していたら、昨日は真っ暗だったものが 緑色に淡く染色されていました。Flt-1 ,FITCにおいて、1日程度たってから 染色されてくるということがあるのでしょうか？コメントいただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1134-3 - 2009/09/02 (水) 10:35:10 - み H2O2処理は蛍光染色には必要ないのでは。 メタノールもね。 最後の水洗は大丈夫でしょうか・・・抗体は染色後に固定してないからね・・・PBSでは駄目なのかなあ（これは問題ないと思うけど）。 他の抗体染色は上手くいってるのでしょうか。 その結果次第で、一連の染色技術の問題なのか？抗体の問題なのかの区別ができるでしょう。異なる蛍光で観察できる顕微鏡なら（ローダミンなど）染まると分かっている抗体でポジコンとして二重染色すれば良い。

(無題) 削除/引用 No.1134-2 - 2009/09/02 (水) 02:03:01 - CJ 基本的な質問ですが、2次抗体はどの動物のIgGに対する抗体ですか？ その1次抗体が正しく働く確証はありますか（同じ抗体を使って他の人は染色に成功しますか）？

細胞外domainの免疫蛍光染色について 削除/引用 No.1134-1 - 2009/09/01 (火) 12:24:40 - VEGFR-1 はじめまして。免疫染色を始めたばかりですが、どうしてもうまくいかず、アドバイスがあればと思い、メールしました。よろしくお願いします。 培養ヒト大動脈内皮細胞のVEGFR-1(Flt-1)の染色を行おうと考えています。 1次抗体はSANTA CTUZ社製 Flt-1(RR9S):sc-74007で、2次抗体はgoat anti-IgG F(ab')2-FITCを使用しています。核はHoechest 33342を使用。固定したものと、細胞外domainの染色であることから生かしたままと2つの方法でやっているのですが、1回目の時は抗体は細胞外domainなのに、核も、細胞質も、全体も緑色に染色できたのですが、その後はbackもまったく真っ暗になってしまいました。顕微鏡（共焦点）のせいかもと思い、他の標本をお借りしてみましたが、観察はきちんとできます。 以下に現在行っているものを書きますので、些細なことでも構いませんので コメントいただければ幸いです。 1) PBS wash 1回 2) 4%　パラホルムアルデヒド20分固定 3) PBS wash 3回　　最終は5分 4) 0.6%H2O2＋メタノール ( 100μl H2O2, 4900μl メタノール) 20分 5) PBS wash 3回　　最終は5分 6) 2.5% normal horse serum 2滴/well 20分 7) PBS wash 1回　1回5分 8) 一次抗体　over night。 ( PBS＋BSA 1000μl＋0.1% Tween 20 1.0μL＋一次抗体10μL) 9) PBS wash 5分×3回　shakerなし 10) 2次抗体 1時間、暗室(抗体希釈buffer；primary antibody diluted buffer; MQ 18ml＋Alb 18ml＋10×TBS 4ml＋Tween20 40μlの中の1000μL と一次抗体10μL) 11) PBS wash 5分×3回　shaker上で 12) 核染色　MQ4200μL＋ヘキスト21μL 13) MQ水 wash 1回　　5分

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