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(無題) 削除/引用 No.1130-10 - 2009/09/02 (水) 12:02:50 - えりこ 皆さん、ありがとうございます。 APさんのおっしゃる通り、アクチン重合が促進されるだけで、アクチン量の増減はないのかも知れません。ただ、Rhoがアクチン骨格構成に影響するけど、その量にまで絶対影響しないという報告を見つけることができてません。それで、チューブリン抗体があったのでとりあえず使っているという状況です。（その他のコントロールになりそうなタンパク質の抗体が購入しないと無いので、チューブリンで問題なければこのまま使いたいと考えています。） GAPDHは調べたいタンパクと分子量が近いので使いませんでした。おおさんのおっしゃるlamin A/Cというのをよく知らないので、調べてみようと思います。 また、一時期タンパク定量をして量をそろえてからIPなりGST Pulldownなり行っていましたが、時間がかかりすぎるためファイナルデータ以外では定量したくないなと思っています。ちなみに、残った細胞ライセートを後でタンパク定量したことがありますが、その時はアクチンでウエスタンブロットして結構揃っていたのに定量ではバラツイていたことがあり、コントロールはあまり当てにならないと実感しました。今使っているチューブリンはサンプルのアプライ量に対して、アクチンほど太すぎるバンドが出ないのでその点ではコントロールとしては良いのかなとも思っています。 私も一度だけメンブレンをクマシー染色して総タンパク量を示している論文を見たことがあります。今後は念のためそうしようと思います。

総タンパク量であわせる？ 削除/引用 No.1130-7 - 2009/09/01 (火) 12:48:25 - かわさき ２つの観点があるように思います。一つは他人を納得させること。もう一つは自分を納得させること。他人、すなわちreviewerないしreaderですが、極端な話名無しさんの言うようなサチュレーションのトリックを使えばある程度は自分の筋書きにデータを載せることができるわけです。でもこれでは自分は納得いかない。自分を納得させるには相当の緻密な検討が必要です。オールマイティに使える内在性タンパク質はないというAPさんの意見はおそらく正しいでしょう。そうすると自分を厳密な意味で納得させる方法は結局なさそうな気がします。ちなみに総タンパク量であわせるというのはだめなんですか？界面活性剤が入っていても測定できるキットがありますよねえ。

(無題) 削除/引用 No.1130-6 - 2009/09/01 (火) 05:49:27 - おお >[Re:5] 名無しさんは書きました : > ローディングコントロールに好んで使われる蛋白質って元々たくさん存在してるのが多いでしょ。だからwesternしてもすぐサチュレーションしやすいから、少しぐらいばらついたくらいでは全部同じインテンシティになってしまい、 いいか悪いか置いといてそれでも差がなしでよしとしている データーは結構ありそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1130-5 - 2009/09/01 (火) 01:54:09 - 名無し ローディングコントロールに好んで使われる蛋白質って元々たくさん存在してるのが多いでしょ。だからwesternしてもすぐサチュレーションしやすいから、少しぐらいばらついたくらいでは全部同じインテンシティになってしまい、あたかもばっちりきれいにそろってるように見えてしまい、あとで冷静になってそのことに気づいて、いったい私は何を補正してるのか？、という感じになるおそれがあります。それでアプライ量を直線性のある範囲まで減らすと今度は少なすぎて自分のみたいものがよく見えなくなったりしてまた困ることがあります。アプライ量を変えて別々のゲルor レーンに流して転写しローディングコントロール用と本番用と用意してもいいけど、これはこれで異論も出てくるかもしれない。そもそも自分の実験でコントロールに選んだ蛋白質が変化しないというのも確証ないし、論文とかでよく使われてるからたたぶんこれでいいんでしょう、みたいな感じで選んでるでしょ。 以上のような問題を回避するため、検出が一通り終わったあとに、膜をクマシで染めて蛋白質染色像で補正してるという人がたしかいたと思う。

(無題) 削除/引用 No.1130-4 - 2009/09/01 (火) 00:54:52 - おお ローディングコントロールは手探り的なところがありますね。 その手の実験をしている人だけが知っているというか、、、、 知ってないこともよくありますが、投稿した時点で どこかのグループが、そのコントロールは動くからと コメントがはいったり、、ま、科学的ではないのですが 周りをよく見るべきかもしれません。 目的のタンパクのりょうが10倍とかうごくようでしたら、 インターナルコントロールが若干動いたとしても説得力は あるとはおもいますし、逆に目的のものが動かないと なると若干そのあたり厳しくなってくるかもしれません。 Cdc2、ヒストンは今回お示しの実験では感覚として怖いですね。 増殖因子による刺激はセルサイクルとリンクしてますし、 両者セルサイクルによりタイトに制御されてますから。 代謝系の遺伝子GAPDHとかの方が無難かと、、、、 厳密にいうと、増殖刺激はミトコンドリアの活性化にも 関与しそうですが、切りがないですから、、、、、 そうするとlamin A/Cとかのほうが無難かなぁ、、、 単に同等量のタンパクが乗っていることを示すなら CBBやメンブレンをアミドブラックetcでそめたものでも いいかと思います。 あるいはそのデーターをとっておいて、クレームが 入った時点でそのデーターでたいしょするとか。

(無題) 削除/引用 No.1130-3 - 2009/08/31 (月) 22:03:18 - ウキ ＞コントロールとしてオールマイティに使える内在性タンパク質はない、 究極的にはそうですが、現実的にはひとつのコントロールで通用している論文がほとんどです。（これはどこにそのトピックがありますでしょうか？よろしければ示してください。） よって、現実的には、１つの蛋白が変化していなければよろしいということです。私はしつこく、２つ変化しないコントロールを意図的においたことがあります。 具体的には、ネットワーク的に関係がないと思われる蛋白をおくのがいいでしょう。たとえば、もし、該当の系に関係がほとんどないのなら、Cdc2、ミトコンドリア蛋白、ヒストンなどがあげられるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1130-2 - 2009/08/31 (月) 17:11:06 - AP >増殖因子などの刺激によりRhoが活性化すると一過性にアクチンストレスファイバーが増加することも知られています。 それって、アクチンの発現とか存在量が増加すると言うことを意味しないのでは。細胞中にあるアクチンモノマーの重合が促進されるということであって。 >そこで、ウエスタンブロットの内在性のローディングコントロールによく用いられるβ-Actinやγ-Tubulinが本当にコントロールになるのか疑問に思っています。 アクチン、チュブリンに限らず、常に定常的に存在し、コントロールとしてオールマイティに使える内在性タンパク質はない、というのが最近のトピで論議されてませんでしたっけ？

ウエスタンブロットのローディングコントロール 削除/引用 No.1130-1 - 2009/08/31 (月) 16:10:46 - えりこ ウエスタンブロットのローディングコントロールについて教えてください。 私は低分子GTP結合タンパク質のRhoファミリーに関する実験をしています。Rhoファミリーは細胞のアクチン骨格再構成に関与しており、細胞運動や形態変化に重要な分子です。増殖因子などの刺激によりRhoが活性化すると一過性にアクチンストレスファイバーが増加することも知られています。 そこで、ウエスタンブロットの内在性のローディングコントロールによく用いられるβ-Actinやγ-Tubulinが本当にコントロールになるのか疑問に思っています。文献によってはどちらも普通に使われているようです。現在は、γ-Tubulinを用いていますが、これが適当なのか、あるいは他に適したコントロールがあれば教えてください。よろしくお願いします。

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