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転写活性 トピック削除
No.1129-TOPIC - 2009/08/31 (月) 15:39:50 - BY2
いつも参考にさせていただいております。
タバコ培養細胞BY2株に調べたいプロモーター配列を組み込んだレポーター遺伝子と35Sプロモーターで過剰発現させた転写因子遺伝子、内部標準をパーティクルガンで導入してルシフェーラーゼアッセイを行っております。
　ルシフェラーゼアッセイ自体はうまく動いているんですが、サンプル間のばらつきがひどく、内部標準で補正してもかなりのばらつきが出ます。こんなものなんでしょうか？
　また、コントロールとしてエフェクターなしや、35Sプロモーターの後ろに何も入れないものを用いましたが、かなり値が高いです。プロモーター配列を短くしたほうがよいのでしょうか？
　よろしくご指導お願いします。
　
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No.1129-7 - 2009/09/02 (水) 08:37:18 - BY2
おおさん、ありがとうございました。
ご意見を参考に考えてみます。

(無題) 削除/引用
No.1129-6 - 2009/09/02 (水) 00:54:15 - おお
>[Re:5] BY2さんは書きました :
> おおさん、ありがとうございます。ノックダウンですか、、、うーん。
> 現在、調べてる転写因子が４つあるので、それぞれのノックダウン株を作るのは大変なのでおそらく無理です。(実際、それらの内在性転写因子で値があがってるのかも疑わしいです。)

こういう場合は内在性の因子の発現を調べないと進めないと思いますよ。
KDがだめなら、その因子が結合すると考えているDNA配列に変異をいれて
みてはどうでしょうか。

あとは内在性の因子の発現が変化するような条件を探してプロモーター
活性とのそうかんをとってみるとか。

そういう意味ではマイクロあれーのデーターベースはそれを説明する
材料になるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.1129-5 - 2009/09/01 (火) 11:50:36 - BY2
おおさん、ありがとうございます。ノックダウンですか、、、うーん。
現在、調べてる転写因子が４つあるので、それぞれのノックダウン株を作るのは大変なのでおそらく無理です。(実際、それらの内在性転写因子で値があがってるのかも疑わしいです。)ノックダウン株は理研などで植物体のものは手に入ると思います。別のアプローチとしては何があるでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1129-4 - 2009/09/01 (火) 09:52:46 - おお
>[Re:3] BY2さんは書きました :

> 　値については、これも毎回ばらつくんですが、最近のものでいうと35sで過剰発現させたlucが平均50万で、エフェクターなしで目的のプロモーターにlucをつけたものが70万くらいです。何も入れないのに過剰発現より値が高いのはやはり細胞由来のものが影響しているからでしょうか？


50万とかと言うとそこそこ高いですね、細胞内で十分活性ありと判断しても
いい数字です。50と70万という比較では、まぁ差がなしと言わざるおえない
でしょう。内在性の発現がおおく、さななる過剰発現がワークしないときは
マンマルの細胞であればノックダウンを使ったりしますが、可能でしょうか?
十分発現しているか確認する必要はありますけど。

(無題) 削除/引用
No.1129-3 - 2009/09/01 (火) 08:08:03 - BY2
　おおさん、ありがとうざいます。たしかに導入効率については考えなくてはいけないです。
　ばらつく原因としてDNAの割合やゴールドを均一に数枚のマクロキャリアーに載せること、細胞回収時の差なんかを考えています。DNAについては現在、レポーター：エフェクター：内部標準＝1:0.5:1でやってます。細胞は腰高シャーレに細胞を撒いてボンバートメント後、それに培養液を加えてそのまま振盪しています。マクロキャリアーにゴールドを撒くときはなるべく均一になるようにボルテックスしながらとってますが、撒くと均一に負けたか不安です。
　値については、これも毎回ばらつくんですが、最近のものでいうと35sで過剰発現させたlucが平均50万で、エフェクターなしで目的のプロモーターにlucをつけたものが70万くらいです。何も入れないのに過剰発現より値が高いのはやはり細胞由来のものが影響しているからでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1129-2 - 2009/09/01 (火) 05:07:41 - おお
植物は扱ってないので事情が違うとはおもいますが、
バラつくのは導入効率が原因ということはないでしょうか?

値が高いと書いていますがどれくらいの値でしょうか?

細胞の内在性のその転写因子の発現が高いのなら、別のアプローチ
も考えた方がいいかもしれません。

転写活性 削除/引用
No.1129-1 - 2009/08/31 (月) 15:39:50 - BY2
いつも参考にさせていただいております。
タバコ培養細胞BY2株に調べたいプロモーター配列を組み込んだレポーター遺伝子と35Sプロモーターで過剰発現させた転写因子遺伝子、内部標準をパーティクルガンで導入してルシフェーラーゼアッセイを行っております。
　ルシフェラーゼアッセイ自体はうまく動いているんですが、サンプル間のばらつきがひどく、内部標準で補正してもかなりのばらつきが出ます。こんなものなんでしょうか？
　また、コントロールとしてエフェクターなしや、35Sプロモーターの後ろに何も入れないものを用いましたが、かなり値が高いです。プロモーター配列を短くしたほうがよいのでしょうか？
　よろしくご指導お願いします。
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