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(無題) 削除/引用 No.1128-15 - 2009/09/26 (土) 12:52:31 - おお >[Re:14] 神経質さんは書きました : > > レチノイン酸を加えていないのに神経突起らしきものをのばしている細胞が少し（3〜5%くらい？）見受けられるのも若干気にはなってますが、 それらしき細胞は確かにみうけられます、わたしが かっていた細胞でも。 染めたりしてみないと分からないと思いますが、 突起を出しているからといって神経突起とは言えませんので、、、、 ファイブロでもコンディションによっては神経突起 のようなものを出しているような形態の細胞が あったりします。形態だけでは判断出来ないとおもいます。

なるほど。 削除/引用 No.1128-14 - 2009/09/26 (土) 12:12:29 - 神経質 いつも書き込みありがとうございます。 やはり、そんなにはがれやすい印象ではないのですね。 輸送で弱ったのでしょうか。。。 血清が合わないのでしょうか。。。 確かに細胞はまるっこいです。一応張り付いているのですが。 レチノイン酸を加えていないのに神経突起らしきものをのばしている細胞が少し（3〜5%くらい？）見受けられるのも若干気にはなってますが、もうしばらく培養を続けてみようと思います。 ちなみに、培養ディッシュはNunc製品（nunclonΔ処理）を使用しております。

(無題) 削除/引用 No.1128-13 - 2009/09/26 (土) 05:09:30 - おお >[Re:12] 神経質さんは書きました : > おかげさまで、Neuro2aを購入して培養をスタート致しました。 > 細胞と同封されてきたData Sheetにはトリプシン処理で継代せよと > 記載されておりますが、やさしいピペッティングだけで易々とはがれます。 > わたしが扱ったものはそれ程はがれやすいという印象はありませんが、 細胞自身丸い状態の物がおおいですね、増殖中のものは、 順調に増えているのであればまず大きな問題はないとはおもえますが、、、 最近ファルコンなどのディッシュはロットむらがあったりとか コストを下げるために表面処理がいまいち甘いのでは という噂をききます。 あと ディッシュのメーカーと細胞の相性みたいなものもたまに話が出たりしますね。 Techno Plastic Products(http://tpp-us.com/docs/tpp-tissue-culture-dishes.html?gclid=CKuu_oTHjZ0CFUdM5QodLVRm2Q) のセールスマンがきて、表面加工にきをくばっていると自慢してました。 確かにファルコンよりしっかりくっついて(N2aでないですが) 細胞がよりヘルシーにみえます。 >[Re:10] 神経質さんは書きました : > おおさん、経験談とアドバイスをありがとうございます。 少し前の質問で、いまさらかもしれませんが、同時おこたえすると。。。。 > > リポフェクトアミン2000よりも毒性の少ない製品、、、 > 入れっぱなしでOKのトランスフェクション試薬、、、 > リポフェクトアミンLTXもその１つでしょうか。 リポフェクトアミンLTX の使用経験はありませんが、いいと聞きます。

(無題) 削除/引用 No.1128-12 - 2009/09/25 (金) 16:48:54 - 神経質 おかげさまで、Neuro2aを購入して培養をスタート致しました。 しかしながら、少々不安がございまして、ご意見を伺いたく思います。 順調に増えていることは増えているのですが、接着性が弱いようです。 細胞と同封されてきたData Sheetにはトリプシン処理で継代せよと 記載されておりますが、やさしいピペッティングだけで易々とはがれます。 現況は、 届いた細胞を6 mmディッシュ1枚に起こし（見た目ではかなりの高密度 だったが、添付指示に従った）、24時間後にはコンフルエントになったので （張り付いただけ）100 mmディッシュ１枚に継代。その後３枚に継代。 という状況です。 初期に薄播きにすると良くないと言われますので、その点に気をつけながら 継代しております。また、継代はTwice a weekとなっておりますが、増殖に 倍くらいの時間を要しております。 コーティングの指示はないのですが、コラーゲンディッシュなど 使った方が良いのでしょうか？ みなさんはどのように培養しておられますか？

納期 削除/引用 No.1128-11 - 2009/09/02 (水) 11:13:49 - 神経質 先ほど、ATCCの注文書を確認したところ、 基本的に納期は３〜４週間と明記してありました。 失礼いたしました。

貴重な情報をありがとうございます 削除/引用 No.1128-10 - 2009/09/02 (水) 10:36:46 - 神経質 おおさん、経験談とアドバイスをありがとうございます。 ＞どの程度の発現量 私の知識の乏しさにより「ChIPやレポーターができる程度」としか言えないのですが、 その他、細胞抽出物をウエスタンして、明確にバンドが確認できる必要があります。 すいません、うまく答えることができません。 リポフェクトアミン2000よりも毒性の少ない製品、、、 入れっぱなしでOKのトランスフェクション試薬、、、 リポフェクトアミンLTXもその１つでしょうか。 私たちの研究室ではLTXを使用しておりますので、 これで十分な結果が期待できそうですね。 さて、ATCCを通してSH-SY5Yを購入することになりそうですが、 だいたいどのくらいで届くのでしょうか？ 理研からしか細胞を購入した経験がなく、ATCCは海外からの輸送と なるのでやはり１ヶ月くらい見てた方が良いのでしょうか？ 品質チェック後に送付ならもっとかかるでしょうね。 まぁ、買うしかないんですけど。。。

(無題) 削除/引用 No.1128-9 - 2009/09/02 (水) 01:06:36 - おお >[Re:3] 神経質さんは書きました : > 該当の論文では、ES細胞から分化させたものを使ったりしており、 > 私たちの研究室では実験することができません。 > > pc12の場合、誘導後に神経様の細胞になるそうですが、 > こうした細胞の場合、発現ベクターやレポーターベクターは、 > どの段階でトランスフェクトするのでしょうか。 > トランスフェクト後に誘導？誘導後にトランスフェクト？ どちらでも理屈ではOKだと思いますが、 分化後のほうがトランスフェsクションがむずかしいかも、、、 最近のトランスフェsクション試薬は入れっぱなしでOKという ものもありますし、誘導直前、または同時にトランスフェクション しトランスフェクションしたバイチ(+添加物NGFとかでしょうか)で 誘導するてもあるかもしれません。 けい時的にみるなら、安定導入株という方法もありかと。

(無題) 削除/引用 No.1128-8 - 2009/09/02 (水) 00:58:50 - おお >[Re:5] 神経質さんは書きました : > > 一方、SH-SY5Yへの遺伝子導入は容易なのでしょうか？ > リポフェクション法で遺伝子導入できますかね？ > 実際に使用した経験談などございましたらお聞かせ下さい。 どれくらいの発現を望んでいるかにもよりますが、 リポフェクタミン2000で一応納得が行く結果をえています。 リポフェクタミンはもう少し毒性の低い製品も後続出ていますので、 やってみる価値はあるのではないかと思います。 あとfugene 6(だったかな)でも行けると思います。 燐酸カルシウムでもそこそこOKです。

(無題) 削除/引用 No.1128-7 - 2009/09/01 (火) 14:25:48 - 神経質 ななこさん、ありがとうございます。 同様の解析をしている論文をいくつか見つけることができました。 また、過去のトピックではリポフェクトアミンでPC12に遺伝子導入を している方もいるようでした。使いやすそうな細胞ですね。 できればマウスかヒトの細胞でやりたいという点を覗けば、第一選択の 細胞となりそうです。 過去トピに「SH-SY5Y細胞は少し扱いづらい」とのコメントがありますね。 むむむ。結局はやってみないとわからないといったところでしょうか。 もう少し論文で、似たような実験をやってる例を探してみようと思います。

PC-12への遺伝子導入 削除/引用 No.1128-6 - 2009/09/01 (火) 13:57:18 - ななこ PC-12は通常の培養は10%FCS,5%Horse serumで行われ、細胞は球体をしています。神経様突起は、serum starvationの後、NGF刺激などすると見られます。私が先輩に習った遺伝子導入は、通常の培養条件下で行い、その後、導入した遺伝子が突起伸長に影響するのか調べるため刺激したりしてました。

本当に助かります。 削除/引用 No.1128-5 - 2009/09/01 (火) 11:49:53 - 神経質 みなさんありがとうございます。 Neuro2a細胞は非常に良く使われている細胞のようですね。 JCRB細胞バンクから入手可能のようですし、まずはこれについて詳しく 調べてみようと思います。 SH-SY5Yはヒト由来なのですね。マウスとヒトの両方で検証したいので これについても詳しく調べてみようと思います。 Neuro2aは、トランスフェクション試薬の広告でも見られますね。 遺伝子導入も比較的容易にできそうな印象です。 一方、SH-SY5Yへの遺伝子導入は容易なのでしょうか？ リポフェクション法で遺伝子導入できますかね？ 実際に使用した経験談などございましたらお聞かせ下さい。

(無題) 削除/引用 No.1128-4 - 2009/09/01 (火) 07:16:22 - おお 培養が簡単ということであれば、ニューロブラストで 株化されたものが支えるかもしれませんね。すでにあがってますが N2aとかSHーSYー5Yやその親株(株の名前忘れましたが、、、) LNなんとかという細胞もあったような気がします。 あとはp19とか分化可能なECとかも使かえるかもしれません。 くわえてGageらが樹立方法をかくりつした方法で、neuronal stem cells を作って売っていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.1128-3 - 2009/08/31 (月) 14:36:18 - 神経質 該当の論文では、ES細胞から分化させたものを使ったりしており、 私たちの研究室では実験することができません。 pc12の場合、誘導後に神経様の細胞になるそうですが、 こうした細胞の場合、発現ベクターやレポーターベクターは、 どの段階でトランスフェクトするのでしょうか。 トランスフェクト後に誘導？誘導後にトランスフェクト？ 神経細胞をあつかうのは初めてなので、なかなか勝手が分からないのです。 参考になる論文だけでも紹介いただけると非常に助かります。 どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1128-2 - 2009/08/31 (月) 14:25:58 - 通りすがり neuro2aとかpc12とかでしょうか？ 論文でまずは探してください。

神経細胞をつかった試験系 削除/引用 No.1128-1 - 2009/08/31 (月) 14:15:22 - 神経質 神経細胞で機能している転写因子の解析をするために、 レポーター遺伝子試験やChIPをしたいと思ってます。 その際、適した細胞としてどのようなものが挙げられますか。 増殖できる株化された細胞など、扱いやすいものが理想ですが、 おすすめの細胞がございましたら教えて下さい。 ちなみに、軸索の伸長や分化誘導を見る予定はありません。 とりあえずレポーターアッセイやChIPが成立すれば良いと思ってます。

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