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(無題) 削除/引用 No.1118-10 - 2009/09/04 (金) 17:26:25 - おいどん 13回膜貫通型タンパクの場合、sample bufferを加えた後のboilingをやめて、そのままwestern blotに用いることにより正しいサイズに出たことがあります。加熱が悪影響の様でboilすると一切バンドは消えてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1118-9 - 2009/09/01 (火) 08:29:37 - シュン integral membrane proteinということなので、細胞をホモジナイズした後に、0.1M Na2CO3、氷中で３０分程度処理して、膜に結合しているperipheral membrane protein 外して、それで100,000xgで遠心して沈殿の膜画分を採るとintegral membrane proteinが濃縮されるのでうまく検出できたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1118-8 - 2009/09/01 (火) 00:21:14 - おお 加えておきます。まくフラクションを超遠心なしでとる方法もあります。 TRITON X-114で可溶化(4度とかで)して、37度とかで遠心するとTRITON X-114が、水分と2相分離します。TRITON X-114のフラクションに膜タンパクなどが濃縮されます。多分この方法はキット化されているとおもいます。ピアスとか、、、、ですから、いきなり組織をTRITON X-114で可溶化するのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1118-7 - 2009/09/01 (火) 00:02:37 - おお >高分子量のスメアバンドは糖鎖の有無にかかわらず強く出るので，糖鎖によって抗体の結合が阻害されている可能性はあまり高くないと考えています。 あ、これを見落としていました。 糖鎖と無関係ですか、、、、未消化とか、ノンスペとか、ユビキチン化とか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1118-6 - 2009/08/31 (月) 23:56:39 - おお あグッているかもしれませんが、それに対する反論として、 なぜ細胞でちゃんと検出できるのか(あぐっていればゲルの トップとかにつまったりしてみれないかのうせいがありますので)。 なぜ糖鎖を切るとあぐってないタンパクが検出されるのか ということが挙げられます。 低張で細胞をバーストしているなら、膜画分はかなりSUPにきている と思えます。ですからプロトコールが若干チグハグしている印象 をうけます。少なくとも、PPTに望むタンパクが効率よく回収できているか 確認するべきではないかともおもえます。 そのプロトコールであればSUPを高速遠心(できれば超遠心)でまくフラクションを 回収した方がいいかもしれませんよ。 あとあぐっているならウレアをSDSPAGEのゲルにも加えるとよくなるかもしれませんが、 それはやったでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1118-5 - 2009/08/31 (月) 17:49:21 - 通りがかり 膜タンパクがアグることはよくあります。 細胞表面でアグるよりも、ERだかゴルジだか知りませんが細胞内小器官にアグったものが蓄積しているケースが多いように思います。ですから plasma membrane を分画精製し、可溶化剤をいろいろと検討すれば改善されるケースがあります。

(無題) 削除/引用 No.1118-4 - 2009/08/31 (月) 13:52:39 - 膜タンパク嫌い おおさん，コメントありがとうございました。 データはどうしてもSDS-PAGEで出す必要があり，糖鎖を切ったもものと並べてバンドを出さなければいけないのです。 グラジエントゲルについては考えていませんでした。ちょっと検討してみたいと思います。事情によりできればIPはしない実験で行きたいので，レクチンで落とすのは難しいです。 Tris-EDTAには塩を入れていません。膜画分もsupに入っていると思うのですが，細胞質のタンパクがバックの原因になると考え，一度可溶成分を捨てています。そのままTritonで可溶化するより多少濃縮されているのでは無いかと。 高分子量のスメアバンドは糖鎖の有無にかかわらず強く出るので，糖鎖によって抗体の結合が阻害されている可能性はあまり高くないと考えています。 やっぱりアグっている（？）ブツを無理矢理はずす方法なんて無いんですかね...。

(無題) 削除/引用 No.1118-3 - 2009/08/30 (日) 08:03:16 - おお >[Re:1] 膜タンパク嫌いさんは書きました : > > 。サンプルはTris-EDTA bufferでホモジナイズ，遠心，ペレットを1% Tritonで可溶化，遠心，上清を使う，という方法で準備しています。 この辺をまだ読んでなかったので、コメントを再度アップします。 TRIS-EDTAバッファーで一度けんだくする理由は何でしょうか? 塩(150mM Na+ etc)は含まれているのでしょうか、 塩が含まれていないなら細胞が 低張のため破裂して膜フラグメントが次の遠心でsupにきてない でしょうか。塩が含まれていなくてもけんだくの仕方が物理的に強ければ、 同じ可能性があります。そういう場合はいきなりTRITONなどの界面活性剤 を使う方がいいかもしれません。 目的のものが多く含まれるフラクションをうまく取ってくるというのも きれいな高感度のウエスタンのコツになり得ます。

(無題) 削除/引用 No.1118-2 - 2009/08/29 (土) 01:42:45 - おお 糖鎖にバリエーションがあるだけで、正しい(何を持って正しいかわかりませんが)位置にえいどうされているのではないでしょうか、、、、、 検出が困難ということであれば、ELISAの系を確立するとかいうのもてだと思います。 SDSPAGEでどうしてもと仰るなら、ゲルの濃度を若干高めにするとか、 10ー20%とかのグラジエントとかでスメアな幅が狭まるような工夫をされてもいいかもしれません。 T/Cも若干上げれば効果あるかもしれませんが、手探りになるかとはおもいます。 たとえばレクチンでプルダウンすると濃縮されてWBで検出しやすくなるとか ありませんか? ほかの可能性としては、糖鎖でエピトープ部位が隠れている可能性ですが、 抗体がどこを認識するのかなど１度確認された方がいいかもしれません。

膜タンパク質のウェスタン（組織抽出物） 削除/引用 No.1118-1 - 2009/08/28 (金) 20:24:28 - 膜タンパク嫌い 膜タンパク質のウェスタンで悩んでいます。ターゲットは50kDaくらいの糖タンパク質で，膜12回貫通だと考えられています。強制発現系では正しいサイズのバンドが見えているのですが，高分子量（100kDaくらい）にも凄く濃いスメアのバンドがあります（アグっているか多量体だと思われます）。糖鎖をPNGaseで切るとバンドがシフトすること，Mockではバンドが全く見られない（高分子量のスメアも）ことから，抗体はWorkしていると思います。 問題は，組織抽出物を用いるとバンドが検出されないことです。厳密に言うと，PNGaseを効かせればバンドがシャープになって検出できます。しかし糖鎖が付いたままだとスメアになっているせいかバンドが見えないのです。組織抽出物でも100kDaくらいの濃いスメアのバンドは観察されます。サンプルはTris-EDTA bufferでホモジナイズ，遠心，ペレットを1% Tritonで可溶化，遠心，上清を使う，という方法で準備しています。Sample bufferにはf.c.で2%のSDS，100mMのDTTが含まれています。ボイルの有無でバンドに変化はありませんでした。Sample bufferに8M Ureaを入れてもダメでした。載せるサンプル量をこれ以上増やすのは難しいです。 この高分子量に出ているバンドを，少しでも正しいサイズのところに持ってこられないでしょうか？ この手の質問は散々既出なのは承知していますが，過去ログに書いてあることは一通り試したつもりです。何かサジェスチョンを頂ければ幸いです。

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