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(無題) 削除/引用 No.1116-9 - 2009/08/31 (月) 10:36:06 - muramura レスいただいた皆さん、ありがとうございます。 とりあえず、PCRの反応自体に問題ないかどうかを検討します。 そののち、ご指摘いただいた点につき一つ一つ検討していきます。 追ってご報告いたしますので、その不具合があった際はまたよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1116-8 - 2009/08/30 (日) 08:51:10 - おお PCR自身がうまくいってなくて、ノンスペをみている可能性は ないでしょうか、、、、、 ノンスペというのは完全なダプルストランドでなくて、掴み所が ないような場合があります。バンドが現れたり消えたり、移動度が毎回違ったり。。。 あと、PCR後のDNase活性の失活も考えるべきでしょうけど、 マテリアル(サンプル)自身の精製度(DNaseのコンタミなど)も 考慮に入れた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1116-7 - 2009/08/30 (日) 08:20:28 - ザンギ すごく稀なことですが、電気泳動のバッファーを変えるとバンドが消えたり 現れたりすることがあります。 DNA断片の長さや組成、配列に依存すると想像されますが、理由はよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1116-6 - 2009/08/29 (土) 17:49:01 - AP 可能性としてPCR反応液から持ち込まれるpolymeraseのexonuclease活性をあげましたが、今ある情報から可能性をあげつらえば、制限酵素、バッファー、水、器具などにDNaseがコンタミしているとか、鋳型DNAサンプル由来のDNaseが残存しているとか、何らかの原因で（たとえばPCR反応液の持ち込み量が多いので制限酵素消化バッファーの組成が大きく狂うために）スター活性が出ているとか、泳動サンプルの調製が不適切で移動度がおかしくなっているとか、いろいろ考えられます。たとえば、制限酵素処理の後分解してしまったのと同じPCR産物で、今やっている制限酵素反応と同じ条件で制限酵素だけ抜いたコントロール実験をしてみるとかして、まず原因がどこにあるのか確かめることを強く勧めます。 その上で、PCR反応から持ち込まれるpolymeraseが原因だとしたら、PCR産物をフェノール抽出、カラム精製などルーチンな方法で精製してからやればいいだけなんですが、genotypingなどで多数のサンプルを扱うなら、それがやりやすい方法を考える必要があると思います。 ・校正活性のないストレートなTaq polを使えば、精製しなくてもDNAの分解を起こさないかもしれない。 ・proteinase Kを加えてpolymeraseを分解する。poteinaseは55℃以上の熱処理（たとえば70℃、10分）で失活させてから制限酵素反応に持っていく。

反応時間変更後もバンドなし 削除/引用 No.1116-5 - 2009/08/29 (土) 16:42:21 - muramura 　奴隷頭さん、APさんのご指摘に従い、反応時間を1時間に短縮して 制限酵素反応を行いました。 しかしながら、バンドが検出されない不具合は改善されませんでした。 つきましては、今後どのような改善策が考えられますでしょうか。 APさんのご指摘のように、PCR産物のpolymeraseを失活させる方法を選択するべきでしょうか？ また、今回の症状の場合、どのような方法で失活させるのが妥当でしょうか？ 皆様よろしくご教示の程をお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1116-4 - 2009/08/28 (金) 20:58:56 - muramura 奴隷頭さん、APさん アドバイスありがとうございました。 ご指摘に従い、まずは反応時間を1時間で試してみます。 結果が得られ次第追ってご報告させていただきます。 万が一不具合が残るようでしたら、その際はまたアドバイスを頂戴したいと思いますので、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1116-3 - 2009/08/28 (金) 19:40:01 - AP DNaseがコンタミしているという疑いがあり、そのソースはDNAサンプルの可能性が高いでしょう（ほかはちゃんとしたDNase-freeの試薬類でしょうから）。 サンプルDNAはPCRで調製しているということですが、反応液を特に前処理することなく、そのまま7 uLとって制限酵素反応に入れているということでしょうか。だとすると、またproof-reading活性のあるpolymeraseを使っているとすると、そのproof-reading活性（3' exonuclease活性）で分解している可能性があります。 制限酵素消化の時間を、分解がそれほど進まない程度に短くするか（1時間もあれば十分でしょう）、polymeraseを除去するか殺すかしてから制限酵素消化にもっていくとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1116-2 - 2009/08/28 (金) 18:27:38 - 奴隷頭 オーバーナイトの反応をやめて１時間程度にする。

制限酵素反応後のバンド消失について 削除/引用 No.1116-1 - 2009/08/28 (金) 17:35:44 - muramura 現在、ある遺伝子のSNP、その2種類について検討しているところで、使用する制限酵素は　それぞれ、BstNIとMspIです。 いずれも、制限酵素反応前に電気泳動してＰＣＲ産物が生成しているのは確認できています。 トラブルの内容としては、制限酵素反応後にバンドが検出されないことです。 スメア状になることもあれば、そうでないときもあります。 Digestionのプロトコールは �@MspI　使用ＳＮＰ Water　 　　　　　　　　　　 1μl NEbuffer 4 　　　　　　　　 1μl DNA　　　　　　　　　　　　 7μl MspI(10u/μl) 　　　　　　　　1μl 最終容量　　　　　　　　　 　10μl 37℃　オーバーナイト �ABstNI 使用ＳＮＰ Water　 　　　　　　　　　　0.9μl NEbuffer 2 　　　　　　　　 1μl DNA　　　　　　　　　　　　 7μl BSA 0.1μl BstI (10u/μl) 　　　　　　　　1μl 最終容量　　　　　　　　　 　10μl 60℃　オーバーナイト です。 今回のようなトラブルの場合、どのような対処法が考えられますか？ なにとぞご教示ください。

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